shrna lkb1慢病毒载体构建 转染和表达的研究-construction, transfection and expression of shrna lk b1 lentiviral vector.docx

Abstractexpression,andconstructthelentivirus.Afterbeingtransfected,theexpressionofLKB1mRNAandproteinwereobviouslyinhibited.Ourexprimentsprovidedexperimentalbasisforthelaterresearch.Keywords:shRNA,LKB1,humanhepatocellularcarcinomacells目录第1章引言1第2章材料与方法22.1菌株及细胞株、主要实验试剂及仪器等22.1.1菌株及细胞株22.1.2主要试剂22.1.3主要试剂的配制32.1.4主要仪器、材料62.1.5载体信息72.2慢病毒载体的构建82.2.1LKB1干扰序列的设计82.2.2克隆制备与鉴定82.2.3慢病毒的包装与滴度检测82.3慢病毒感染细胞92.3.1准备目的细胞92.3.2目的细胞慢病毒感染预实验92.3.3目的细胞慢病毒转染10PCR检测细胞LKB1的MRNA水平11WESTERNBLOT检测细胞LKB1蛋白的表达水平112.6统计处理13第3章结果143.1慢病毒感染后细胞图片14REAL-TIMEPCR检测感染效果14WESTERNBLOT检测蛋白表达水平17第4章讨论18第5章结论与展望21致谢22参考文献23攻读学位期间的研究成果26综述27中英文缩略词表英文缩写英文全称中文名称LKB1liverkinaseB1肝脏激酶1shRNAshorthairpinRNA短发夹RNAHCChepatocellularcarcinoma肝细胞型肝癌PJSPeutz-Jegherssyndrome黑色素斑-胃肠道多发性息肉综合征ADAAmericanDiabetesAssociation美国糖尿病学会EASDEuropeanAssociationforTheStudyofDiabetes欧洲糖尿病研究协会TEMEDN,N,N,N-TetramethylethylenediamineN,N,N,N-四甲基二乙胺APAmmoniumpersulphate过硫酸铵AMAcrylamide丙烯酰胺SDSdodecylsulfate,sodiumsalt十二烷基硫酸钠SDSsodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸TBSThermomorphicbiphasicaminesolvent叔丁基二甲基硅烷DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟GAPDHglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶AMPKAMP-activatedproteinkinase腺苷酸活化蛋白激酶mTORmammaliantargetofrapamycin哺乳动物的雷帕霉素靶体PIKKphosphatidylinositol-3kinase-relatedkinase磷脂酰肌醇-3激酶相关的激酶第1章引言近十几年来，糖尿病的患病率逐年上升；并且糖尿病花费巨大、病情难以控制，已逐步成为全球公共卫生问题，它的预防和控制也已经成为主要卫生优先事项之一[1-2]。不仅如此，糖尿病患者发生恶性肿瘤的风险也大大增加[3-4]。现在，越来越多的证据表明，糖尿病是导致多种消化道恶性肿瘤的风险因子，糖尿病患者的肝癌发病率增加[5-6]。肝癌是我国的常见恶性肿瘤之一，包括原发性肝癌和转移性肝癌，其中，肝细胞型肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）约占原发性肝癌的85%-90%。目前在全球范围内，HCC在癌症死亡最常见的原因中位居第三。HCC的风险因素包括病毒感染、黄曲霉素、酗酒、吸烟、超重、肥胖、糖尿病、家族性遗传因素、饮食等等。对于糖尿病引起肿瘤的确切机制，目前尚不清楚，目前大家比较认同的观点是与糖尿病及其诊治过程中所引起的胰岛素抵抗、高血糖以及高胰岛素血症等因素有关。LKB1基因，又称为STK11基因，其编码的LKB1蛋白是一种由433个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。LKB1首次发现于发现黑色素斑-胃肠道多发性息肉综合征（Peutz-Jegherssyndrome,PJS)的研究中，该患者体内存在LKB1基因的等位基因缺失[7-8]。后来人们又陆续发现，在非小细胞型肺癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌患者体内的LKB1基因也都发生了等位基因突变