新型靶向药物fim-a对骨肉瘤pi3kaktmtor通路的影响-effect of new targeted drug fim - a on pi 3 kakmtor pathway in osteosarcoma.docx

英文缩略语表mTOR4E-BP1mammaliantargetofrapamycineIF4E-bindingproteins1哺乳动物雷帕霉素靶蛋白真核细胞翻译起始因子结合蛋白AktElisaHIF1aMVDp70S6KPCNAPCRPI3KTSCVEGFproteinkinaseBenzyme-linkedimmunosorbentassayhypoxiainduciblefactor-1amicrovesseldensityribosomalS6kinaseproliferatingcellnuclearantigenPolymeraseChainReactionphosphatidylinositol3-kinasetuberoussclerosiscomplexVascularendothelialgrowthfactor蛋白激酶B酶联免疫吸附测定低氧诱导因子-1a微血管密度核糖体激酶增殖细胞核抗原聚合酶链反应磷酯酰肌醇-3-激酶结节性硬化症血管内皮细胞生长因子新型靶向药物FIM-A对骨肉瘤PI3K/Akt/mTOR通路的影响目的：中文摘要1体外培养大鼠骨肉瘤UMR-106细胞株，构建裸鼠骨肉瘤原位移植瘤模型，为研究mTOR蛋白靶向药物FIM-A（AP23573）对大鼠骨肉瘤的影响构建实验平台。2检测mTOR蛋白在大鼠成骨细胞和骨肉瘤细胞，以及骨组织和裸鼠骨肉瘤中的表达。3研究mTOR蛋白靶向药物FIM-A（AP23573）对骨肉瘤UMR-106细胞增殖、周期、凋亡以及血管形成相关因子分泌的影响。4研究mTOR蛋白靶向药物FIM-A（AP23573）对大鼠骨肉瘤“原位移植”模型肿瘤体积、PCNA、微血管密度以及凋亡的影响。5研究mTOR蛋白靶向药物FIM-A（AP23573）对于大鼠骨肉瘤PI3K/Akt/mTOR通路的影响并探讨可能治疗机制。方法：1体外培养大鼠骨肉瘤UMR-106细胞，原位注射法构建裸鼠原位瘤模型。2采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）法，从mRNA水平检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白在大鼠成骨细胞和骨肉瘤细胞、大鼠骨组织和裸鼠模型的原位肿瘤组织中的表达情况。3采用10-5，10-6，10-7，10-8，10-9M五个剂量的FIM-A（AP23573）作用于UMR-106单细胞，CCK-8试剂、流式细胞术、Elisa（酶联免疫吸附法）分别观察药物对细胞增殖、周期凋亡、以及HIF1a（低氧诱导因子1）和VEGF（血管内皮生长因子）分泌的影响。4采用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg三个剂量的FIM-A（AP23573）作用于裸鼠原位移植瘤模型，观察药物对荷瘤裸鼠的体重，以及肿瘤体积、生长抑制率、微血管密度（CD34）、增殖抗体PCNA变化、细胞凋亡因子CC3的影响，评价抗肿瘤活性。5观察mTOR靶向药物FIM-A（AP23573）对大鼠骨肉瘤UMR-106细胞以及骨肉瘤裸鼠原位移植瘤PI3K/Akt/mTOR通路上游mTOR，p-mTOR,以及下游4E-BP1、p-4E-BP1、p70S6K,p-p70S6K的变化的影响，探讨其治疗骨肉瘤的可能机制。结果：1建立了大鼠骨肉瘤裸鼠原位移植瘤模型。2正常SD大鼠成骨细胞以及骨组织的mTOR、4E-BP1、p70S6K表达均较大鼠骨肉瘤细胞以及裸鼠模型的原位肿瘤组织低。3FIM-A（AP23573）能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR-106细胞的生长，最大作用浓度在10-5和10-6M间；并使肿瘤细胞周期停滞在G1期，明显减少HIF1α和VEGF的分泌，但是对细胞没有明显的促进凋亡作用。4在体内实验中，FIM-A（AP23573）能够显著抑制肿瘤体积的增长，免疫组化显示FIM-A（AP23573）能够抑制移植瘤细胞增殖，减少血管密度，但没有明显的促凋亡作用。5通过Westernblot检测发现，FIM-A（AP23573）能够下调大鼠骨肉瘤UMR-106细胞以及骨肉瘤裸鼠原位移植瘤PI3K/Akt/mTOR通路上游p-mTOR,以及下游p-4E-BP1,p-p70S6K的表达，从而达到治疗骨肉瘤的目的。结论：1应用UMR-106细胞原位移植的方法能够构建稳定的裸鼠骨肉瘤模型。2PI3K/Akt/mTOR通路蛋白在骨肉瘤中存在异常表达和活化，可成为mTOR靶向治疗的靶点。3在体外实验中，FIM-A（AP23573）能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR-106细胞的生长；在体内实验中，FIM-A（AP23573）能够有效抑制骨肉瘤的增长和血管形成。4FIM-A（AP23573）可能是通过下调大鼠骨肉瘤UMR-106细胞以及骨肉瘤裸鼠原位移植瘤PI3K/Akt/mTOR通路上游p-mTOR,以及下游p-4E-BP1,p-p70S6K的表达，从而使肿