《生物化学精品教学-广西医科》唾液淀粉酶的最适pH测定.docVIP

唾液淀粉酶的最适pH测定 【摘要】唾液中含有一种有催化活性的蛋白质—唾液淀粉酶，可以催化淀粉水解为麦芽糖。本实验采用唾液淀粉酶为材料来观察pH对酶活性的影响。已知淀粉在该酶的催化作用下会随时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。淀粉溶液属胶体溶液，具乳样光泽，与碘反应呈蓝色，无自由半缩醛羟基，不具还原性。底物淀粉消失的快慢可以用来衡量酶活性的高低。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应的显色反应中，碘-淀粉络合物在波长为660nm处的吸光度值最大，从而间接测出唾液淀粉酶的最适pH值。酶；酶活性；唾液淀粉酶 ?生物体内的酶是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核酸，前者是机体内催化各种代谢反应最重要的催化剂。酶分子中的许多极性基团。在不同的H条件下解离状态不同，其所带电荷的种类和数量也各不相同，酶活性中心的某些必需基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大的催化活性。许多具有可解离基团的底物和辅酶的荷电状态也受H改变的影响，从而影响酶对它们的亲和力。此外，H还可以影响酶活性中心的空间构象，从而影响酶的活性。因此，H的改变对酶的催化作用影响很大。?酶催化活性最高时反应体系的H称为酶促反应的最适H。? pH 试剂 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 0.2mol/L Na2HPO4溶液/ml 0.62 0.93 1.33 1.88 2.45 3.05 3.60 0.2mol/LNaH2PO4 溶液/ml 4.38 4.07 3.67 3.12 2.55 1.95 1.40 加水稀释至10ml 将配好的溶液分别置于已标号的试管中待用 唾液的获取： 蒸馏水漱口后在口中含蒸馏水，适宜时间后将蒸馏水连同唾液一同放置于事先准备好的容器中即可，在实验过程中应注意酶的失活，为了防止此现象发生应将此液体置于冰水中冷却； 淀粉用量的确定 表二：淀粉用量的确定 用量（ml） 试管 试剂 1 2 3 空白 7.0pH缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L淀粉 0.1 0.2 0.3 - 唾液（稀释10倍） 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37°C水浴7.5min，然后每管加两大滴碘液 蒸馏水 5.9 5.8 5.7 6 混匀，观察现象，并选择适中一支，记录其用量 结果：0.1ml?2.5g/L淀粉为最适量（颜色最浅） 结果：观察到酶稀释倍2号管颜色最浅，所以酶稀释倍最适合? 5、测定唾液淀粉酶的最适PH： 表五：测定唾液淀粉酶最适PH所加试剂表 管号 1 2 3 4 5 6 7 pH 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 pH缓冲溶液（3ml） 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L淀粉（ml） 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 酶液（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 37℃ 恒温水浴7.5min 碘液 2大滴 加入5ml蒸馏水 吸光度A660nm 0.785 0.672 0.653 0.638 0.625 0.650 0.667 6.??以A660为纵坐标，pH为横坐标作图。 ?本次试验中，在pH值6.0～范围内碘-淀粉络合物吸光度值随pH的增大先减小后增大，根据图表，吸光度A值最小是唾液淀粉酶pH值为6.8时，即本次试验所测唾液淀粉酶的最适pH?值是6.8。??? 讨论?本实验中，当唾液淀粉酶的活性最大时，淀粉被分解的最多，剩余的底物的量最少，A值最小，过酸或者过碱均会影响酶的活性，使之分解的底物减少，A值增大。??由所作曲线可知唾液淀粉酶的最适pH值在6.左右。在H6.8时唾液淀粉酶的活性随H的升高而增大，在H=6.8达到最大值，在H6.8时唾液淀粉酶的活性随H的升高而降低，因此唾液淀粉酶的最适pH值为6.，如果过酸或过碱均会降低酶的催化活性。??最适H不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液种类与浓度以及酶纯度等因素的影响。溶液PH高于或低于最适H时，酶活性降低，远离最适H时还会导致酶变性。在测定酶活性时，应选用适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定。根据已知生物化学实验测得的唾液淀粉酶的最适pH值为6.9。本次实验所测的最适pH距标准值误差0.1。 ?假设可能的原因：??（1）在制备酶方面存在不足??①这种方法制备的酶的浓度差异较大；?②忽略了各人的酶对酸度的适宜程度不同。? 实验条件的设置不够理想。?①固定的缓冲液配