分子生物教学（中南大学）第八章 基因工程与基因体外表达.pptVIP

目的要求 掌握：限制性核酸内切酶的概念与特点；质粒载体的特点；基因克隆的基本过程。 了解：其他常用工具酶的特点。 【重点】基因克隆的基本过程。 人肿瘤坏死因子基因序列 ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGGGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGTTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA黄色序列为引导序列 分析序列的酶切位点网址 Webcutter 2.0 http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ 序列处理在线工具包 /sms/ 提取HL-60细胞mRNA， 逆转录生成cDNA, 用设计好的引物进行PCR, 琼脂糖凝胶电泳, 纯化PCR产物, 用限制性核酸内切酶切割ＰＣＲ产物和载体，连接酶切产物，导入大肠杆菌，筛选阳性克隆，ＤＮＡ序列分析，培养细菌，诱导表达。 （四）平端连接 四、外源DNA导入宿主细胞 （一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection） 五、目的基因的筛选和鉴定 外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。 （一） 遗传学方法 插入灭活法 1. 2. 蓝-白筛选（α互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。 （二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 （三） 核酸杂交法 对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。 菌落原位杂交的原理 转化 E. coli并铺于琼脂平板上 将膜放置 平板表面 定位、揭起 变性、 中和、 固定 杂交、 洗膜、 显影 （四） PCR技术 具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。 (五) 酶切鉴定 用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。 举例： 人肿瘤坏死因子在大肠杆菌中的表达 Webcutter 2.0 * 第八章 基因工程与基因体外表达 Gene Engineering and Gene Expression