DNA双链断裂与修复：一个潜在的乙肝病毒整合的分子机制.pdf.doc

华中科技大学 博士学位论文 DNA双链断裂与修复：一个潜在的乙肝病毒整合的分子机制 姓名：任精华 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：林菊生 华中科技大学博士学位论文 DNA双链断裂及修复：一个潜在的乙肝病毒整合的分子机制 华中科技大学同级医学院附属同济医院肝病研究所 博士研究生：任精华 导 师：林菊生教授 中文摘要 目的与逆转录病毒感染不同，乙型肝炎病毒的整合不是病毒复制所必须，HBV本身 也不编码整合酶，整合过程需要宿主细胞酶系的参与。尽管如此，乙肝相关性肝癌组 织标本中 HBV DNA整合的检出率高达 80％。大量研究显示：HBV DNA的整合能引 起插入突变、DNA缺失、染色体重排甚至基因组的不稳定性。此外，整合型 HBV DNA 导致原癌基因的激活及抑癌基因的失活也备受研究者关注。然而，乙肝病毒整合入宿 主基因组的分子机制至今尚未阐明。在过去的三十年中，学者们主要集中在寻找 HBV DNA在宿主染色体上的优势整合位点以及与肿瘤发生发展相关的整合靶基因，如癌 基因、抑癌基因、信号转导因子、细胞周期调控因子等。迄今为止，已有 60余种基 因被成功鉴定为 HBV DNA整合的靶基因，这其中包括维甲酸受体（ Retinoic acid receptors; RAR）、细胞周期蛋白 A（cyclin A）、端粒酶催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase; hTERT）等一些与原发性肝癌密切相关的基因。hTERT更是被认 为是 HBV整合的优势靶位。研究结果还表明，HBV DNA的整合可发生在除 13、X 和 Y外的所有染色体上。鉴于 HBV整合过程中呈现出来的多样性和复杂性，目前的 观点多数认为 HBV在染色体上的整合是随机的。这一随机性体现在两个方面：一方 面，整合到宿主细胞的 HBV DNA往往不是完整的病毒序列，在已描述的 HBV DNA 整合片段中未检测到两个完全一致的序列；另一方面，HBV DNA整合入宿主基因组 的部位是随机分布的。然而，随着研究的进一步深入，有结果发现 DNA损伤的诱发 尤其是 DNA双链断裂以及 DNA修复的干预均可大大增加乙肝病毒基因组的整合频 率。于是有人设想，DNA双链断裂（Double-strand break; DSB）可能是 HBV DNA整 合的一个潜在的靶位点。这样，人们必然要问，HBV DNA的整合是如何发生的？整 3  华中科技大学博士学位论文 合之前宿主细胞内发生了哪些事件？HBV DNA的整合可以控制吗？如果我们弄清了 这些过程，就可以采取有效措施干预乙肝病毒的整合，从而从源头上预防病毒整合所 致的基因组不稳定性以及肿瘤的发生。我们知道，针对 DNA损伤，人体内存在着一 套保持基因组完整性（integrity）和忠实性（fidelity）的 DNA修复机制。研究业已表 明，机体可通过同源重组（homologous recombination; HR）和非同源末端连接 （non-homologous end-joining; NHEJ）两种修复途径对 DSB进行修复，避免因为复制 停顿而引起的细胞死亡。两种修复途径各自拥有其门控蛋白（ gatekeeper），HR的 gatekeeper是 Rad52；NHEJ的 gatekeeper是 Ku70/Ku80。DSB发生后，两类门控基因 竞争结合 DNA断端，从而引导两种不同的修复途径。本课题旨在验证 DSB是 HBV DNA整合的一个潜在的优势靶点，并试图从损伤修复这一全新的视角入手，探讨两 种 DSB修复途径与 HBV整合的关系，通过调控启动 DSB两种修复途径的门控蛋白 Rad52和 Ku70/Ku80，促使机体采用无错（error free）的 HR途径，而不采用易错（error prone）的 NHEJ途径，遏制乙肝病毒的整合，力图从源头上干预病毒整合所致的基因 组不稳定性及肝癌的发生。 方法应用分子克隆技术构建 I-SceⅠ系统中的真核表达载体 pEGFP2，将其转染人胚 胎肝细胞株 L-02和肝癌细胞株 HepG2，G418筛选出稳定转染株，从而人为地将 18 个碱基的 I-SceⅠ归位内切酶识别序列（5’-TAG GGA TAA CAG GGT AAT-3’）引入 到细胞的基因组中。随后将 I-SceⅠ系统中表达 I-SceⅠ内切酶的真核表达载体 pCMV-3NSL-I-SceⅠ瞬时转染到 L-02和 HepG2细胞中，诱发产生位点特异性的 DSB 细胞模型。瞬时转染后 24 h