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2008年5月 初始污染菌检测 初始污染菌检测 参考标准 《中华人民共和国药典》2005版 附录 微生物限度检查法 ISO 11737-1:2006 Sterilization of medical devices – Microbiological methods – Part 1: Determination of a population of microorganisms on products GB/T 19973.1 /ISO 11737-1:1995 医疗器械的灭菌 微生物方法 第一部分：产品上微生物总数的估计 GB 15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 检测环境及检验量 应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向空气区域内进行 一般供试品的检验量为3~10个独立包装的同批次供试品。（见ISO 11737-1:2006 A8.1） 实验材料及设备 营养琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 滤器、微孔滤膜（孔径0.45微米，直径50mm）、量筒、剪刀、镊子、培养皿 过滤装置、电子天平、压力蒸汽灭菌器、生化培养箱等 供试液的制备 用？ml 氯化钠-蛋白胨缓冲液浸提？小时（包括最内层包装的内壁） -所需供试液的用量和浸提时间需验证 处理方法：振动、冲洗、擦拭法、袋蠕动、超声、涡旋混合、搅拌 举例—振动 小型医疗器械可以投入无菌的自封袋中，加入缓冲液充分振动。 另外，用缓冲液冲洗内包装袋的内壁。并与产品缓冲液相混。 转至培养基 膜过滤法—适用于微生物浓度较低的悬液 平板倾注—适用于微生物浓度较高的悬液 平板涂布—适用于微生物浓度较高的悬液 螺旋涂布 薄膜过滤法 培养 药典中的培养条件： 细菌 30-35℃ 48h 霉菌、酵母菌 23-28 ℃ 72h 必要时，可适当延长培养时间至5-7天 菌落计数 计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。 菌落特征： ⑴ 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、 淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC(氯化三苯基四氮唑试剂)，菌落为红色） ⑵ 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。 ⑶ 大小差异很大。 计数方法的验证—回收率 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 A 试验组 供试液+试验菌（50~100cfu） B 菌液组 试验菌（50~100cfu） C 供试品对照组 D缓冲液对照组 缓冲液+试验菌（50~100cfu） (A-C)/B70% D/B70% 菌落计数报告规则—平板法 选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在30~100之间的稀释级作为报告菌落数的依据。 1）如只有1个稀释级平均菌落数符合上述规定，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。 2）如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30～300之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。 高稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数 比值=———————————————————— 低稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数 当比值≤2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告；当比值2但不超过5时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；当比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再进行检查，必要时，应进行方法的重新验证。 3）如各稀释级平均菌落数均在300以上，则按最高平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低平均菌落数乘以稀释倍数报告。 4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数 菌落计数报告规则—薄膜过滤法 每张滤膜上的菌落数应不超过100个 点计滤膜上的菌落，例如：对整件样品以？cfu/件报告 若滤膜上无菌落生长，以“＜1cfu/单位”报告菌落数 * * * 主要步骤 采样 供试液制备 培养 菌落计数 梯度稀释 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 供试液 9mlNacl 9mlNacl 1:10 1:100 1:1000