核酸检测技术2014ppt课件.ppt

HIV耐药检测 什么是HIV耐药性？ HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变异， 产生对药物抑制作用敏感性降低或不敏感 的现象。 药物的作用机制 核苷类逆转录酶抑制剂：被靶细胞的细胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式与天然三磷酸竞争，从而参与病毒DNA的合成，由于该抑制剂经化学修饰，将导致病毒DNA链合成终止。 药物的作用机制 非核苷类逆转录酶抑制剂：是一组结构多 样化的化合物，通过非竞争性的方式结 合于或者接近于病毒逆转录酶的活性位 点，从而抑制病毒逆转录酶的活性。 药物的作用机制 蛋白酶抑制剂：肽类似物，通过结合于病 毒蛋白酶的活性位点来抑制酶的活性，使 之不能将病毒合成的多聚前体蛋白水解为 病毒的各种结构蛋白和酶的组成部分。 耐药性是怎么产生的？ 一、病毒本身的因素——内因 1.1HIV的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错误倾向性。 1.2在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随时发生 耐药性是怎么产生的？ 二、药物的选择压力——外因 1.1在药物选择的压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快能发生在14至28天内。 1.2耐药株是在病毒自发的、高频率的基因突变中产生的，在药物选择性的压力下优势复制的结果。 哪些因素促使耐药性病毒株出现？ 1.病毒载量 2.服药的依从性 3.药物的配伍不当 4.其他因素：胃肠道吸收不好，随意间歇服药，与中药或其他药物同时服用。 如何检测耐药株？ 目前耐药性检测有2种方法：表型检测和基因型检测。 表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用低，技术也相对容易，可在样品收集后1~2周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其他药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以通过直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛运用于临床的是基因型耐药检测。 表型检测方法 表型耐药性检测 优点：直接定量测定耐药性 结果容易解释 有临床临界值（cut-off) 可立即检测对新药的耐药性 缺点：操作复杂、价格昂贵、耗时长 HIV基因型耐药性检测 （序列测定法） 基因型检测方法（序列测定法） 标本 新鲜EDTA抗凝血浆，或-80℃ 保存，避免反复冻融。 病毒RNA提取（Qiagen公司试剂盒） 耐药性突变记分 高度耐药：大于60分 中度耐药：30~59分 低度耐药：15~29分 潜在低度耐药：10~14分 敏感：0~9分 HIV-1耐药性检测的临床指征 1.抗病毒治疗病毒类失败需要改变抗病毒治疗方案时应进行耐药性检测以协助选择有效的抗病毒药物。 2.抗病毒治疗病毒载量下降不理想时可进行HIV-1的耐药性检测。 3.抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行检测。 HIV-1耐药性检测的临床指征 4.急性HIV-1感染的病人进行抗病毒治疗，最好进行耐药性检测，对于选择合适的抗病毒药物、取的最佳抗病毒效果很有益处。 5.对于未经抗病毒质量的慢性HIV感染者不一定要做耐药性检测，但当有迹象显示感染的是耐药性HIV毒株时（例如感染来自于正在服用抗病毒药物的病人），就应当进行耐药性检测。 6.不推荐对病毒载量1000CP/ML的病人做耐药性检测，因为病毒水平太低很难扩增出目的基因片段。 耐药性检测结果的解释 1.HIV-1的耐药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性检测结果的分析和解释都有困难。 2.所有的抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的，即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他药物的抗病毒活性。 3.药物即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变的病毒比敏感毒株的复制适应性要差得多。 4.血清中药物的水平，特别是蛋白酶类药物是高度变化的，如果能够提高血清中蛋白酶类药物的浓度，低水平的蛋白酶耐药性有时能够被克服。 耐药检测在临床中应用 儿童HIV感染的诊断 儿童感染HIV的途径 大部分儿童感染HIV是由母婴传播。 宫内经胎盘传染、产时分娩过程中创伤性操作和经产道分泌物传染、生后母乳喂养经乳汁传染。 血液传播 儿童艾滋病的流行病学特点 全世界已有百万儿童感染了HIV。 75~90%的小儿感染的HIV来自母亲。 育龄女性HIV感染者急剧增加。 造成儿童感染艾滋病人数大幅度增长。 儿童HIV/AIDS诊断 （一）流行病学史 1.母亲HIV阳性。 2.有输血或血液制品史，或有