试验项目：Far-WesternBlot分析CryAb蛋白和小菜蛾中肠-yzxzcom.docVIP

2014-05-02 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：质谱鉴定能和Cry2Ab蛋白结合的中肠蛋白 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2014-05-02 计数月份：2014年5月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计不足，实施错误 6%-10% 设计不全，实验无果 11%-15% 设计可以，实施不全 16%-20% 设计完整，分布实施 21%-25% 实验不全，记载无果 26%-30% 实验不足，记载不全 31%-35% 独立实验，记载不全 36%-40% 分布实验，记载完整 41%-45% 目的明确，实验完成 46%-50% 实验完整，记载清晰 51%-55% 实验系统，结果可信 56%-60% 实验创新，分析清晰 61%-65% 实验创新，结论清晰 66%-70% 实验完整，统计清晰 71%-75% 实验系统，数据可靠 76%-80% 报告完整，文章雏形 81%-85% 结构合理，分析有据 86%-90% 逻辑清晰，统计合理 91%-95% 图表完整，写作流畅 96%-100% 文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前应用最广泛的微生物杀虫剂，其特征之一是孢子形成的过程中同时产生伴孢晶体（主要成分是有杀虫效应的δ-内毒素），其中的Cry蛋白是杀虫机理研究最透彻、应用最广的δ-内毒素之一[1,2]。 目前Bt毒素的杀虫机理尚不明确，己被普遍接受的苏云金芽抱杆菌作用机制认为:Bt所产生的C巧毒素蛋白晶体被昆虫取食后，昆虫肠道中的碱性蛋白酶[3]将其特异性的水解，使得毒素前体活化为具有杀虫活性的毒素。活化后的毒素能够特异的与昆虫中肠BBMV上的受体蛋白相互结合，然后这种毒素与蛋白的结合体形成空洞使肠道破损[4]，这些空洞结构能够让水分子和离子自由穿过，破坏了细胞的通透性，和肠道细胞的内环境，最终导致昆虫的死亡[5]。 APN、类钙粘蛋白、ALP、糖脂、肌动蛋白等被推测可能是Bt在小菜蛾BBMV上的受体，但究竟哪种是Cry2Ab毒蛋白的主要受体，与毒素结合后对小菜蛾产生致死效应尚未明确[6]。本研究采用far-Western Blot 鉴定及分析小菜蛾中肠Cry2Ab毒素的受体结合蛋白，并通过质谱将其鉴定出来，从蛋白质水平上来了解小菜蛾对Cry2Ab的抗性形成机制，为有害昆虫的抗性治理提供理论依据。 试验方法 2.1 实验材料 Bt 杀虫蛋白Cry2Ab蛋白由本实验室自行表达纯化；小菜蛾为福建农林大学生态研究所馈赠。 2.2 主要试剂 Cry2Ab鼠单抗购自上海佑隆生物科技有限公司；兔抗鼠二抗、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)购自碧云天生物科技有限公司；PVDF膜购自Millipore公司。 2.3 实验方法 2.3.1 小菜蛾中肠BBMV的提取 选取四龄末期小菜蛾100头，抽取其中肠，参照Wolfersberger的Mg-EGTA沉降法提取小菜蛾中肠BBMV。 2.3.2 far-western blot寻找Cry2Ab蛋白的受体蛋白 小菜蛾中肠BBMV经10% SDS分离，采用湿转将蛋白转到PVDF膜。10%的脱脂奶粉封闭一小时，加入5μg Cry2Ab蛋白孵育一小时，此时Cry2Ab蛋白的受体可以和Cry2Ab蛋白结合从而把Cry2Ab蛋白结合到PVDF膜上；用抗Cry2Ab蛋白的一抗进行Western Blot进行检测，显影能显出条带的便有可能是Cry2Ab蛋白的潜在受体。 2.3.3 质谱鉴定Cry2Ab蛋白的受体蛋白 将上一步能显影的蛋白条带切下，利用MALDI-TOF-MS进行蛋白鉴定。 试验结果 3.1 far-western blot寻找Cry2Ab蛋白的受体蛋白 实验通过far-western blot(两块相同的SDS胶，一块用于考染；另一块转膜后和Cry2Ab蛋白孵育，再进行放射自显影)寻找Cry2Ab蛋白的受体。BBMV的Cry2Ab蛋白的受体能和Cry2Ab蛋白结合，在和Cry2Ab蛋白孵育后便能把Cry2Ab蛋白结合在PVDF膜上，此后再用抗Cry2Ab蛋白的一抗去做WB杂交，能显出条带的为结合有Cry2Ab的BBMV蛋白，即Cry2Ab蛋白的潜在受体。 小菜蛾中肠BBMV 10%的SDS如图1A所示；经Cry