《细胞培养技术》PPT课件.ppt

MTT比色实验 活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物Formazan并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。 DMSO能溶解细胞中的Formazan，在490 nm处有吸收，可间接反应活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 特点：灵敏度高，重复性好，操作简便，经济，快速。 步骤： 1. 接种细胞：用0.25 ％的胰蛋白酶消化细胞，用10％小牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种于96 孔板，每孔200μl。 2. 培养细胞：培养3-5 天 3. 显色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）,20μl，继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内的培养上清液（对于悬浮细胞，需离心1000 rpm 5 min,然后弃去孔内培养液）。 每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，使Formazan充分溶解。 4. 测A490。 注意事项： （1）选择适当地的细胞接种浓度：一般情况下， 96孔板孔内贴壁细胞长满时约有100，000个 细胞，但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，进行MTT实验前，对每一种细胞都应测定贴壁率，倍增时间，以及接种细胞数条件下的生长曲线，然后测定实验中每孔接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满，保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。 （2）避免血清干扰。 （3）设空白对照。 XTT比色实验 在目前的细胞活性检测实验中，MTT 比色实验具有简便，快速，灵敏等优点而被广泛应用，然后，由于MTT 经还原所生成的甲臢 Formazan 不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使实验增加，也影响实验的准确性。 XTT 是一种类似于MTT 的四唑氮衍生物，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢 Formazan 产物。当XTT 与电子偶合剂（PMS）联合应用时，所产生的水溶性Formazan 产物与活细胞的数量成正比。 特点：使用方便，检测快速，灵敏度高， 可以检测较低的细胞密度。检测细 胞密度的线性范围大，重复性优于 MTT。 缺点：XTT水溶液不稳定，需现用现配，或低温保存。 Cell Counting Kit-8 ?CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。 其基本原理为：该试剂中含有WST–8［其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐］， 它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢染料（Formazan dye）。 生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 ??CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。 多做实验，多思考！！ In doing , we learn. 体外培养细胞大致分四型： 1. 成纤维细胞型： 2. 上皮细胞型： 3. 游走细胞型： 4. 多型细胞型： 1. 成纤维细胞型： 细胞质常向外伸出2－3个长短不一的突起，突起的数目不同，细胞形态有梭型、扇型、星型。细胞边缘不整齐，胞浆透明。细胞核呈椭圆形，核仁明显。 细胞可单独活动。细胞不紧靠，连成片，而是呈漩涡状、放射状。 有：心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、胶质细胞等。 2. 上皮细胞型： 细胞呈扁平不规则多边形，角为钝角，大小相仿，中有圆形核。细胞外观透明，生长时呈薄膜状移动，细胞彼此紧密相连成单层膜。上皮膜边缘的细胞总是与膜相连，很少脱离细胞群单独活动（连接成片）。 如：表皮细胞、乳腺、消化道上皮、肝、胰、肺泡上皮细胞等。 3. 游走细胞型： 细胞散在生长，常活跃地游走，或作变形运动，速度快且方向不规则，一般不连成片。如起源于网状内皮系统的细胞。 4. 多型细胞型： 神经细胞。 （二）悬浮型 细胞呈圆形，单个细胞或呈小细胞团，悬浮生长。 优点：易大量繁殖、易传代、易收获。 缺点：观察不方便。 二、细胞培养常用术语： 1. 细胞培养：cell culture,细胞在体外条件下生 长。在细胞培养中，细胞不再形成组织。 2. 体外培养转化：细胞在体外培养中发生与原细 胞遗传性状不同的变化，但不一