王镜岩生物化学第三版第4章_蛋白质的共价结构.ppt

第４章 蛋白质的共价结构;蛋白质 （Protein）; 蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。;一、蛋白质通论;;２、蛋白质的含氮量;３、蛋白质的分类;（2）、依据蛋白质的组成分类;简单蛋白;结合蛋白;（二）、蛋白质的大小与分子量;;蛋白质与多肽无严格的界线 ——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大;（三）蛋白质构象和结构的组织层次;示 例;;;;（四）、蛋白质功能的多样性;;二、肽（peptide）;;由两个AA组成的肽称为二肽。 由多个AA组成的肽则称为多肽。 组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。;多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离?-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离?-羧基的一端：羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln;（一）、肽和肽键的结构;①肽键中C-N键有部分 双键性质 ——不能自由旋转 ②组成肽键原子处于 同一平面（肽平面） ③键长及键角一定 ④大多数情况以反式 结构存在;共价主链 ;（二）、肽的物理化学性质;（三）、 天然存在的重要多肽;;;;三、蛋白质一级结构的测定;;1.样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;;（一）、蛋白质测序策略;;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 ;Sanger法 ;二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 ;;—N=C=S + N—CH—COOH;肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量， 按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 蛋白质N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮???酸氨肽酶 —水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。;肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质;（二）、末端氨基酸残基的鉴定;肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) ∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 ∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 ;（三）、二硫键的断裂;1、酸水解; 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 ;R1=Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制）;R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2=Pro（抑制） pH8-9;R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 ;R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2 ;肽链;2、化学裂解法 ①溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 ; ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 ;3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法 ;N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。;PITC;2、氨肽酶法或羧肽酶法;;;;;核糖体;（七）、肽段在多肽链中次序的决定;胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置;胃蛋白酶 最适pH约2，此时二硫键不断开 专一性低、肽段短;;（九）、蛋白质测序举例;（十）蛋白质序列数据库 ; 同源蛋白质：来自不同生物体、