人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因克隆及表达.docVIP

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因克隆及表达 　　【摘要】 目的 扩增人幽门螺杆菌（Hp）热休克蛋白A(HspA)编码基因并构建其重组表达载体，进行核苷酸序列分析，并在E.coli BL21中表达，为疫苗的开发奠定了基础。 　　方法 利用PCR技术从Hp基因组DNA中扩增热休克蛋白A（HspA）基因片段，目的基因经SacⅠ和XhoⅠ双酶切、纯化后，插入pET32a(+)载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21并表达。结果 经PCR、酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp HspA编码基因，与GenBank报道的相比较，核酸同源性达98%。经SDS分析，表达的融合蛋白分子量约为33 KD，其中目的蛋白的分子量约为13 KD。结论 成功地克隆并表达了Hp HspA编码基因，为HspA蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。 　　【关键词】 幽门螺杆菌；热休克蛋白A；重组载体；基因表达? 　　文章编号：1003-1383(2007)06-0666-03中图分类号：R 392-33文献标识码：A 　　 　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，在人群中的感染率极高，我国普通人群的感染率为50%～80%，每年新增感染人数近千万［1］。Hp不仅是导致慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤等胃部疾病的主要致病细菌，而且与肠道外疾病的发生也有显著的作用，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原［2~4］。根据Hp的感染，临床上多采用复合抗生素疗法，虽然可以达到一定的效果，但却存在再次感染、诱导耐药菌株流行、药物副作用和费用较高等问题，且不能达到预防Hp感染的目的。因此，发展Hp疫苗是预防Hp感染最有效、最有前景的方法。Hp的致病性包括它的动力、黏附力、尿素酶、磷脂酶A、热休克蛋白和毒素等，其中HspA为所有的Hp共同的抗原成分，可刺激机体产生保护性免疫反应。本研究采用基因克隆技术，构建了含HspA基因的重组质粒，并在E.coli中进行表达,为Hp疫苗的研制奠定了基础。 　　 　　材料和方法 　　 　　1.材料 ①菌株和质粒：标准Hp菌株11637由本校微生物学教研室提供；DH5α、BL21菌株和pET32a(+)载体为本实验室保存。②主要试剂：PrimeSTAR聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、??制性内切酶（SacⅠ和XhoⅠ）、DNA Marker均为TaKaRa公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均为上海华舜生物工程有限公司产品。③引物设计：通过GenBank查询，应用Primer 5.0设计 Hp HspA编码基因的引物P1和P2，P1的序列为5’?GCCGAGCTC-ATGAAGTTTCAACCATTAGG?3’，P2的序列为: 5’?CCGCTCGAG?GTGTTTTTTGTGATCATGAC-3’。P1引物中引入了SacⅠ酶切位点，P2引物中引入XhoⅠ酶切位点。? 　　2.方法? 　　(1)Hp染色体DNA的提取 将Hp标准菌株经布氏肉汤培养液进行培养增菌后，取增菌后的菌液按照DNA提取试剂盒说明进行染色体DNA的提取。? 　　(2)HspA基因的扩增 在50 μl反应体系中，分别加入dNTP 4 μl，基因组DNA（作为模板）3 μl及浓度各为20μmol/L的P1和P2引物各0.5μl，以及PrimeSTAR聚合酶0.5 μl，按照下列条件进行PCR扩增，即98℃变性2 min，然后98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共32个循环，最后一个循环结束后再72℃延伸2 min。所获PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，同时进行20 g/L琼脂糖凝胶回收。? 　　(3)重组载体的构建 将纯化的PCR产物和载体pET32a(+)，分别以SacⅠ和XhoⅠ双酶切，并用PCR纯化试剂盒进行纯化。将酶切纯化的目的基因和pET32a(+)按5∶1（摩尔数）比例，在16℃条件下连接过夜。将10 μl连接产物加入一支感受态细胞中混悬，依次冰浴30 min、42℃水浴90 s、冰浴5 min。最后再在连接产物内加入900 μl LB培养液，于37℃复苏1 h后离心，弃去上清，余少许培养液与沉淀混匀后接种于LB+氨苄青霉素100 mg/L的平皿上，放37℃孵箱过夜。? 　　(4)重组载体的鉴定 ①PCR鉴定：于次日在平皿上分别挑取单个菌落，以细菌本身为模板进行PCR，反应条件为：94℃变性10 min，然后94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32个循环，最后再72℃延伸2 min。所获PCR产物进行20 g