ⅲ型钠通道scn3a基因启动子区cfos转录调控元件的功能研究-study on the function of cfos transcription regulatory element in scn3a promoter region of type ⅲ sodium channel.docx

征并预测与之相关的调控元件，选择预测的 c-Fos 调控元件进行功能研究。采用定点诱变的方法对 c-Fos 调控元件位点进行缺失突变，构建缺失突变后荧光素酶报告基因 表达载体（PGL4-F1.1-cFos-del），分别转染 PC12 细胞和 NGF 诱导的 PC12 细胞后， 根据双荧光报告系统测定的相对荧光素值，统计分析调控元件的功能。为研究转录 因子与调控元件的结合，构建转录因子的表达质粒，并在编码转录因子序列前端插 入编码 V5 标签蛋白的序列，采取 Western Blot 实验证明融合蛋白的表达。合成生物 素标记的带有调控元件的 DNA 探针，采取凝胶阻滞的电泳迁移实验，分析探针与蛋 白的结合情况。结果：1. hSCN3A 基因最小功能启动子及其上游转录调控区的鉴定对 hSCN3A 基因启动子不同长度片段（F0.9、F0.7、F0.5、F0.3、F0.2、F0.1）的 分析表明，F0.9 和 F0.7 与 F1.1 比较，相对荧光素酶活性分别下降约 30%和 80%，这 两个区域为正性调控区域，该区域可能存在正性调控元件；在转录起始点上游 -548 到+ 174 bp 区活性改变不明显, 为最小功能启动子。2. hSCN3A 基因启动子区潜在的转录调控元件使用软件预测 hSCN3A 基因启动子转录起始点上游的正性调控区域内的转录 调控元件，发现了多个潜在的转录调控元件，同时我们选取预测的 c-Fos 转录调控元 件进行后续的功能研究。3. hSCN3A 基因启动子区 c-Fos 转录调控元件上调报告基因表达，且需要 NGF参与通过对 c-Fos 转录调控元件敲除质粒的活性分析，在 PC12 细胞中，野生型质粒 的活性与 NGF 诱导的 PC12 细胞相比较下降 40%，而 c-Fos del 质粒无差异；在 NGF 诱导的 PC12 细胞中，c-Fos del 质粒的活性与野生型质粒相比较下降 50%，而在 PC12 细胞中 c-Fos del 质粒与野生型质粒活性无差异。结果表明，在 PC12 细胞中，只有 在 NGF 诱导条件下，c-Fos 元件才能显著性上调 hSCN3A 基因启动子活性。4. NGF 上调 PC12 细胞内源 Scn3a 基因表达的影响使用 RT-PCR 和荧光定量 PCR 的方法对 PC12 细胞的内源 Scn3a 基因表达进行 分析，RT-PCR 结果显示，在 NGF 诱导情况下，PC12 细胞的内源 Scn3a 基因 PCR的条带浓度明显较无 NGF 时高，同时荧光定量 PCR 显示，在 NGF 诱导情况下，PC12细胞的内源 Scn3a 的转录本明显较无 NGF 时高，上述结果表明 NGF 能上调 PC12 细 胞内源性 Scn3a 基因表达。5. c-Fos 蛋白与转录调控元件不直接结合为研究 c-Fos 与调控元件是否直接结合，本研究首先构建 V5-c-Fos 融合表达载 体，并采用 Western Blot 实验证明异源表达的融合蛋白 V5-c-Fos 是否被运至细胞核。 采取凝胶阻滞的电泳迁移实验，观察 V5-c-Fos 蛋白与转录调控元件的 DNA 片段的 结合，结果显示 V5-c-Fos 蛋白并未与调控元件直接结合。提示 c-Fos 蛋白可能以间 接方式与转录调控元件结合。结论：本研究鉴定了人 SCN3A 基因的最小功能启动子及其上游调控区的功能， 发现在转录起始点上-558 到-549 bp 范围内存在一个有功能的 c-Fos 调控元件，该元 件只有在 NGF 存在的情况下才具有增加 SCN3A 启动子活性的功能，提示 c-Fos 对 SCN3A 基因的表达调控需要 NGF 的参与。关键词：转录调控元件，转录因子，c-Fos， SCN3AFunctional analysis of the transcriptional regulatory element c-Fos in the promoter region of human sodium channel SCN3A GenePostgraduate：Zuying Kuang Tutor：Prof. Weiping LiaoProf. Yuesheng LongKey Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, Institute of NeurosciencandtheSecondAffiliated Hospitalof Guangzhou Medical University, 250 Chang-Gang-Dong Road, G