gdnf与nt3双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗先天性巨结肠的初步研究-preliminary study on transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells modified by gdnf and nt3 in treating congenital megacolon.docx

中文摘要第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养目的：建立一种简便、可靠的 Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 体外分离培养的方法。方法：单纯贴壁法分离培养 SD 大鼠骨髓间充质干细胞，倒置显微镜观察细 胞生长形态，噻唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线，免疫组化法检测骨髓间充质干 细胞标志抗原 CD90、CD44 和造血干细胞标志抗原 CD45 的表达情况。 结果：培养的 BMSCs 为多角形或梭形，大小均一, 呈漩涡状排列生长。免疫 组化检测显示培养细胞高表达 BMSCs 干细胞标志抗原 CD90、CD44，而不表达造 血干细胞标志抗原 CD45. 结论：单纯贴壁法可有效分离、培养和纯化大鼠 BMSCs，为其组织工程的 临床研究应用提供了实验基础。关键词：骨髓间充质干细胞；单纯贴壁法；细胞培养；第二部分SD 大鼠 试验性 巨结肠模型的建立和鉴定 目的：建立一种大鼠巨结肠实验动物模型，为临床开展干细胞移植提供实 验基础。 方法： 200±15g重SD 大鼠110只,随机分为两组。模型组用5 mL/L-1的苯扎 氯铵(BAC)经肛处理大鼠结肠45min，对照组用生理盐水。于术后1、2、4、8周 行大体观察、结肠测压、取处理段结肠行HE染色、神经元特异性烯醇化酶（neural specific enolase,NSE）和蛋白基因产物9.5（protein gene product 9.5,PGP9.5）免疫 荧光染色以及乙酰胆碱酯酶（AchE）组织化学染色观察，RT - PCR 检测AchE、 胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）、 神经营养素3（Neurotrophin-3，NT-3）的表达情况。 结果：术后一周实验组大鼠逐渐出现腹胀，排便减少，解剖发现处理段肠管 痉挛狭窄，上端肠管肠内容物潴留，反射性收缩消失，组织学检查显示肠神经节细胞消失，且Real-Time PCR也证明AchE、GDNF、NT-3的表达明显下调。对照组则无明显改变。 结论：经肛应用5 mL/L-1BAC的方法成功建立了无神经节细胞肠段的大鼠实验 模型，且该模型稳定、可靠、重复性好，为深入研究先天性巨结肠的病理生理提 供了一个可靠的模型基础。 关键词： 先天性巨结肠； 苯扎氯铵；动物模型； 大鼠； 第三部分GDNF 和 FNT-3 双基因真核表达载体的构建目的：构建 GDNF 和 NT-3 双基因共表达的真核表达载体。方法：从新生大鼠脑组织中采用逆转录PCR方法扩增GDNF和NT-3基因序 列，将扩增产物分别克隆到pEGFP-N1载体，然后双酶切各pEGFP-N1载体，回收 目的基因片段，将目的基因片段克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中，构建其真核 表达载体pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3，并对重组体进行酶切及测序鉴定。结果：PCR 扩增片段与预期结果一致，GDNF-NT-3 共表达载体构建成功， 双酶切和测序结果正确。结论： 成功构建了 pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 双基因共表达真核表达质粒 载体。关键词：胶质细胞源性神经营养因子；神经营养素 3；真核表达载体；第四部分pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 真核表达载体在大鼠骨 髓间充质干细胞的表达及成神经诱导目的：探讨重组体 pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 双基因表达载体转染大鼠间充 质干细胞后的表达以及诱导分化为神经细胞的可行性。方法：全骨髓法分离培养 BMSCs，流式细胞术检测骨髓间充质干细胞标志 CD90 和造血干细胞标志 CD45。转染带荧光的 GDNF 和 NT-3 基因，在荧光显微 镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及细胞的形态变化；免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和神经胶质酸性蛋白(GFAP)的表达；Western blot 检测细胞 GDNF 及 NT-3 蛋白表达。对照组为未转染 GDNF 和NT-3 基因的 BMSCs。结果：BMSCs能在体外成功分离培养，细胞高表达CD90 ( 92.7% ) ,不表达 CD45。诱导分化后，BMSCs胞体变圆,伸出明显突起，并可见多数细胞相互交织 成网状结构，呈神经细胞样形态。免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和 NF，而不表达GFAP。而对照组阴性。Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3 蛋白表达增强。结论：研究表明重组质粒pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 转染后可在BMSCs 中 成功表达，转染重组质粒后的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神