glp1四聚体药物蛋白的制备及其药代动力学和药效学的分析-preparation of gl p1 tetramer drug protein and analysis of its pharmacokinetics and pharmacodynamics.docx

独创性声明本人声明所呈交的学位（毕业）论文，是导师的指导下独立完成的研究成果，并且 是自己撰写的。除了文中作了标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已发表或撰写 过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表 示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，特授权福建 农林大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，允许论文被查阅 和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文。必威体育官网网址，在年后解密可适用本授权书。□不必威体育官网网址，本论文属于不必威体育官网网址。□学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目 录摘 要 IAbstractII1文献综述 11.1.1聚乙二醇的性质 31.1.2聚乙二醇修饰的化学基础 41. 2GLP-1 简介41.2.1GLP-1 的结构及理化性质41.2.2GLP-1 的生理功能51.2.3GLP-1 的研究进展61.3亲和素（Avidin）与生物素(biotin)系统71.4蛋白偶联技术简介 81.5立题依据及研究思路 81.5.1论文立题依据 81.5.2研究思路 91.6偶联产物的分离鉴定 101.7偶联产物的分析 112GLP-Avidin 偶联物的制备及产物鉴定132.1材料与方法 132.1.1实验材料 132.1.2实验方法 132.1.3分析方法 142.2结果与讨论 16GLP- Avidin 偶联物制备17GLP-Avidin 偶联产物的纯化192.3小结 193GLP-Avidin 偶联物的结构鉴定213.1材料与方法 223.1.1实验材料 223.1.3分析方法 243.2结果与讨论 24GLP-Avidin 的荧光光谱分析24GLP-Avidin 的动态光光谱分析25GLP-Avidin 的分析超离心结果253.3小结 304GLP-1 四聚体偶联物药代动力学、药效学及免疫原性的研究 314.1药代动力学研究 324.1.1实验动物 324.1.2注射样品 324.1.3实验耗材 324.1.4实验试剂 324.1.5实验仪器 324.1.6实验方法步骤 324.1.7实验结果分析 344.2药效学研究 354.2.1实验动物 354.2.2注射样品 364.2.3实验耗材 364.2.4实验试剂 364.2.5实验仪器 364.2.6实验方法步骤 364.2.7实验结果分析 374.3GLP-1 四聚体偶联物的免疫学性质检测374.3.1实验动物 384.3.2注射样品 384.3.3实验耗材 384.3.4实验试剂 384.3.5实验仪器 384.3.6实验方法 394.4结果与分析 41小鼠抗 Avidin 的 IgM 检测41小鼠抗 Avidin 特异性 IgG 检测425结论与展望 435.1主要研究成果 435.2论文创新点 445.3论文展望 44攻读学位期间发表论文与研究成果清单 51致谢 52摘 要聚乙二醇（PEG）修饰技术可以提高蛋白质和多肽类药物在体内的循环半衰期，降 低免疫原性和抗原性，从而改善药物的药代动力学和药效。然而，常用的PEG修饰方法 多是针对蛋白质上ε-氨基的随机修饰，反应可控性差，修饰产物不均一，存在大量的二 修饰以及多修饰产物，而且有较大产物的活性损失。共价偶联是一种化学交联或化学修饰方法，是将一种多肽或蛋白质偶联在另一种大分子蛋白上，从而达到改善原肽或蛋白的溶解性和其他性质。亲和素与药物可通过共价 键相连形成偶联物，这样不仅可以使药物的分子量变大，避免被肾小球过滤，提高它在 体内的循环半衰期，也大大增强了药物与受体蛋白的亲和力，从而提高GLP-1四聚体偶 联物的生物活性，提升其药效动力学性。本论文以胰高血糖素样肽1为模型蛋白，采用 异型双功能试剂PEG/biotin-Mal与大分子载体Avidin（亲和素）进行连接，以期稳定生物 活性和增强药效。首先制备GLP-Avidin偶联产物。本论文采用异型双功能PEG（biotin-PEG3500-Mal） 连接GLP-1，随后 PEG另一端的biotin分别与亲和素（Avidin）上的四个对称的亚基配对， 从而将4个GLP-1偶联到Avidin上。采用分析型凝胶过滤柱Superdex 200 (1 cm×30 cm)检 测分析以及SDS电泳法检测偶联物，得出最佳反应条件。研究表明，4℃为最适反 应温度；GLP-1:biotin-PEG-Mal:Avidin=4:1:0.5；GLP-1:(biotin- Mal):Avidin=4:1:0.5作