gmcsf联合mtdh基因疫苗抑制前列腺癌生长和转移的作用分析-analysis of gmcsf combined with mtdh gene vaccine in inhibiting growth and metastasis of prostate cancer.docx

中文摘要GM-CSF联合MTDH基因疫苗抑制前列腺癌生长和转移的作用研究研究背景：肿瘤转移以及肿瘤对化疗药物的耐药是肿瘤患者的主要致死原因之一。晚期前列腺癌常发生淋巴结、骨、肺脏等器官转移且容易产生对化疗药物及雄激素抵抗作用，发展为激素难治性前列腺癌(hormone-refractoryprostate cancer, HRPC)。近几年的研究发现MTDH具有癌基因的功能，它调节细胞转化、增殖、侵袭、转移，促进血管新生和降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感；MTDH在前列腺癌组织和培养的前列腺癌细胞中表达明显升高。本文在前期研究的基础上，进一步研究MTDH基因疫苗抑制前列腺癌生长和转移的作用。研究目的：评价肌肉注射MTDH基因疫苗对小鼠前列腺癌RM-1移植瘤抑瘤效果，以及初步探讨GM-CSF免疫佐剂对MTDH基因疫苗的作用机制。研究方法：预防动物模型中采用股四头肌注射法将质粒MTDH肌注免疫雄性C57BL/6 小鼠，2周1次，共3次，每次基因免疫后1、3、5天，皮下注射GM-CSF100 μL（1μg/100μL）。末次基因免疫后第7天，各组取5只小鼠通过流式细胞仪检测免疫后小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞亚群及采用CytoTox96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay试剂盒检测细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）反应。眼内眦静脉采血并用ELISA 检测各组小鼠血清的IFN-γ和IL-4 水平。末次基因免疫后2 周，小鼠皮下接种105/100μL/只RM-1 细胞。接种肿瘤细胞1 周后，观察免疫动物肿瘤的生长情况、用游标卡尺测量肿瘤大小及评估荷瘤小鼠的生存期，并绘制肿瘤的生长曲线图。于接种肿瘤细胞后第21天，处死各组小鼠，称量肿瘤重量并计算抑瘤率，以此来评估该DNA疫苗在小鼠体内的抑瘤效果。用Tunel标记法(脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术)检测肿瘤细胞的凋亡情况，通过常规HE 染色镜检，观察肿瘤组织结构。结果：MTDH基因在RM-1细胞中高表达，而在小鼠各主要脏器组织中表达低。MTDHDNA疫苗同对照组Pub、PBS组比较能显著激发CD8+T 细胞（p＜0.01），CD4+T差别不明显（p＞0.05）；加GM-CSF佐剂预防组与单独MTDH疫苗预防组相比，CD4+T和CD8+T升高均有有显著性差异（p＜0.01）。杀伤实验结果表明:在不同的效靶比下，对RM-1 靶细胞杀伤率不同，100:1 时最高，达12.99%; 预防组、加佐剂组与对照组的杀伤率相比均有显著性差异（p＜0.05）；预防动物模型组肿瘤生长曲线显示，与对照组相比，MTDH 预防组移植瘤生长受到明显抑制（p＜0.05）。GM-CSF佐剂有增强MTDH抗肿瘤作用（p＜0.05）。生存期分析，MTDH预防组和联合GM-CSF组生存期明显长于对照组，而他们两组间生存期无明显差异（p＞0.05）。可以检测到MTDH预防组和联合GM-CSF组小鼠血清细胞因子IFN-γ明显增加。Tunel结果显示佐剂GM-CSF组和MTDH预防组肿瘤细胞凋亡率显著高于两对照组，并且佐剂GM-CSF可显著促进MTDH疫苗对RM-1 移植瘤细胞的抗凋亡作用。结论：MTDH基因疫苗免疫雄性C57BL/6小鼠，可以在小鼠体内产生保护性细胞免疫应答和体液免疫应答，抑制移植瘤生长。且联合GM-CSF佐剂有更强的抑制肿瘤作用，但是联合GM-CSF对荷瘤小鼠生存期无明显影响。关键字：基因疫苗；MTDH/AEG-1；前列腺癌；GM-CSF；肌肉注射ABSTRACTTheeffortsresearchofcombinedGM-CSFandMTDHgenevaccinetoinhibittheprostatecancer’sgrowthandmetastasisBackground:Tumormetastasisandtumorresistancetochemotherapeuticdrugsisoneofthe leadingcauseofdeathforcancerpatients.Theadvancedprostatecanceroftenoccurs organmetastasis,suchaslymphnodes,boneandlung.Anditisproneresistantto chemotherapyandandrogenandbecomesthehormone-refractoryprostatecancer (Hormone-refractoryprostatecancer,HRPC).Inrecentyears,thestudyfoundthat MTDHhadthefunctionofoncogene,whichregulatesthecell’stransfo