gmcsf对替莫唑胺抗高级别胶质瘤细胞的作用-effect of gmcsf on temozolomide against high-grade glioma cells.docx

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被人查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。必威体育官网网址论文在解密后遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日GM-CSF对替莫唑胺抗高级别胶质瘤细胞的作用研究生杨冬谊导师步星耀郑州大学人民医院神经外科中国郑州450003摘要研究背景高级别胶质瘤是成人最常见的原发性脑恶性肿瘤，占脑肿瘤的60-70%，目前的标准治疗为最大化手术切除肿瘤后行放化疗，替莫唑胺是目前被广泛接受治疗脑胶质瘤的化疗药物，主要通过DNA鸟嘌呤的O6和N2位点上的烷基化（甲基化）发挥细胞毒作用，肿瘤耐药现象仍是目前治疗高级别胶质瘤的难题之一。与此同时，与放化疗相关的血液系统毒副作用已引起重视，主要表现为骨髓增生异常综合征、白血病以及严重骨髓抑制，粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）是造血生长因子家族的成员之一,常被用来治疗恶性肿瘤患者化疗所致的的白细胞的数量和/或功能减退，然而应用GM-CSF对脑胶质瘤患者化疗的影响如何仍不可知。研究目的拟应用GM-CSF对高级别胶质瘤细胞进行干预，从而研究TMZ对GM-CSF干预后的高级别胶质瘤细胞的杀伤性并探索其可能的机制。材料与方法1.高级别胶质瘤患者资料收集2013年9至2015年8月收集在河南省人民医院神经外科三病区接受手术治疗的原发性高级别脑胶质瘤患者41例，肿瘤组织均行常规病理检查、免疫组化检测MGMT表达、MGMT启动子甲基化并进行胶质瘤I细胞的培养，患者及家属均签署知情同意书。.高级别胶质瘤细胞的选取和GM-CSFR的检测根据病理结果、MGMT表达水平、基因启动子甲基化状态以及细胞培养结果，选6例高级别胶质瘤细胞进行实验，细胞融合度达90%时进行传代，传至第3-4代细胞稳定后采用免疫荧光法检测GM-CSFR在细胞中的表达。.时间-细胞存活率分析设置TMZ组、TMZ+GM-CSF组和调零组（培养基、MTT、二甲基亚砜），GM-CSF和TMZ终浓度分别为50ng/ml和100μmol/L。培养24h、48h、72h、96h后分别检测细胞的存活率，筛选出最佳的培养时间。4.MTT法检测细胞活性设置对照组、TMZ组、GM-CSF组、TMZ+GM-CSF组、调零组（培养基、MTT、二甲基亚砜），先加入GM-CSF进行干预，12h后加入TMZ 使其终浓度分别为50ng/ml和100μmol/L，72h后检测各组的细胞存活率。.流式检测细胞周期设置对照组、GM-CSF组，细胞传代6h后加入GM-CSF 使其终浓度为50ng/ml，48h后收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期。.流式检测细胞凋亡率设置对照组、GM-CSF组、TMZ组、GM-CSF联合TMZ 组，加入GM-CSF12h后添加TMZ，72h后收集细胞用凋亡试剂盒处理上机检测。结果1.高级别胶质瘤细胞的培养选取选取的6例细胞中间变性星形细胞瘤2 例，多形性胶质母细胞瘤4例；MGMT蛋白表达阴性3例，阳性表达1例，强阳性表达1例，弱阳性表达1例；MGMT基因启动子甲基化的3例，非甲基化的3例。免疫荧光显示胶质瘤细胞均有GM-CSFRα的表达。2.时间-细胞存活率TMZ组、GM-CSF+TMZ组均在培养约72小时后显示出较低的细胞存活率，对胶质瘤细胞的抑制率达到最高。3.MTT法细胞存活率检测6例细胞GM-CSF组的细胞存活率与对照组相比均有不同程度的增加，TMZ组与GM-CSF+TMZ组的细胞存活率均比对照组明显下降。MGMT基因启动子甲基化的3例细胞，GM-CSF+TMZ组的细胞存活率(67.67±1.16， 68.13±1.06, 68.42±1.73)比TMZ组（90.00±1.73，82.33±1.53,82.67±2.11）显著降低（P=0.000，P=0.000，P=0.001），MGMT启动子非甲基II化的3例细胞GM-CSF+TMZ组与TMZ组存活率均无显著差异（P＞0.05）。4.流