gntr型转录因子spd_0064对肺炎链球菌荚膜多糖的调控作用及机制研究-regulatory effect and mechanism of gntr transcription factor spd _ 0064 on streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide.docx

英汉缩略语名词对照英文缩写AP英文名称ammonium persulfate中文名称过硫酸铵bpbasepair碱基对cfuColonyformingunit菌落形成单位ddH2Odouble distilled water双蒸水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DOCDeoxycholic acid脱盐胆酸盐E.coliEscherichia coli大肠杆菌ELISAEnzyme-linked immunoadsorbent assay酶联免疫吸附试验EMSAElectrophoretic MobilityShiftAssay凝胶电泳迁移率实验GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphate三磷酸甘油醛脱氢酶dehydrogenaseHRPhorseradish peroxidase辣根过氧化物酶IPTGisopropylthio-β-Dgalactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KDaKilodaolton千道尔顿LBLria–Bertain mediumLB 培养基MMole摩尔MinNi2＋-NTAMinuteNickel-nitrilotriaceticacid分钟镍-次氮基三乙酸ODoptical density光密度PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate buffered solution磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechain reaction聚合酶链反应rpmrevolutions per minute转/分SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SPFSpecificpathogenfree无特定病原体TBETrisboric acidbuffer硼酸电泳缓冲液1TEMEDN,N,N,N,tetramethyl-ethylene diamineN,N,N,N,四甲基乙二胺μgMicrogramme微克μlMicroliter微升2GntR 型转录因子SPD_0064对肺炎链球菌荚膜多糖的调控作用及机制研究摘要目的荚膜多糖是肺炎链球菌重要毒力因子。通常鼻咽部定植的肺炎链球菌荚膜多糖含量较低，发生侵袭感染后荚膜多糖表达增加。转录水平的调控是一种常见的生物性状调控方式，但荚膜多糖合成调控的相关调控子和调控机制至今尚不清楚。我们前期利用DNApulldown 技术筛选到多个候选蛋白能结合cps操纵子启动子区域，其中SPD_0064蛋白隶属GntR转录因子家族。本研究探讨的是SPD_0064 对荚膜多糖操纵子转录调控的调控效应和分子机制，明确相关宿主刺激因素，并揭示SPD_0064 依赖的荚膜多糖合成调控在肺炎链球菌侵袭致病中的作用。方法采用凝胶电泳迁移率实验（ElectrophoreticMobilityShift Assay，EMSA）明确SPD_0064 与cps操纵子启动子区结合，采用DNase I footprinting实验寻找具体的结合序列，进一步通过结合位点定点突变实验分析结合位点的特异性；构建肺炎链球菌D39型SPD_0064缺陷菌和D39型SPD_0064异位回补过表达菌，在此基础上构建cps-LacZ 报告菌，通过检测β-半乳糖苷酶活性分析SPD_0064缺失对cps操纵子转录水平影响；同时提取野生菌和SPD_0064缺陷菌总RNA，qPCR 检测cps2A-cps2C基因的转录水平，利用Dotblot和ELISA方法分析3野生、缺陷、过表达菌三种菌株CPS含量；体内定点突变SPD_0064与cps操纵子启动区结合位点，分析突变后启动子启动效率；改变培养基中葡萄糖浓度和培养环境温度，寻找体外调控SPD_0064表达的影响因素；构建败血症模型和定植模型，分析各组小鼠生存时间和鼻腔灌洗液细菌载量，明确SPD_0064介导的荚膜多糖合成在细菌侵袭致病中的作用。结果EMSA实验显示SPD_0064能与cps操纵子启动子区域特异结合，DNaseIfootprinting 实验明确SPD_0064结合的具体DNA序列为一段33 bp 的片段（5’-TGTCATGTTCTTATTTCATTTTACTATAT-TTTT-3’），位于转录起始位点上游89-121个核苷酸处；β-半乳糖苷酶活性实验结果显示SPD_0064 基因缺陷后细菌cps 转录水平上调20%；qPCR结果显示，相比野生菌，SPD_0064 缺陷菌cps2A-CmRNA水平平均增加了6倍；DotBlot和ELISA方法分析表明SPD_0064缺陷菌较野生菌CPS 表达水平上调59%，SPD_0064 异位回补过表达菌在SPD_0064 蛋白为野生菌的2倍时，CPS表达水平下调57%；特异性结合位点体