pbld表达缺失参与肝细胞癌的恶性演进及相关分子机制研究-内科学（消化系病）专业毕业论文-pbld lack of expression participates in the malignant evolution of hepatocellular carcinoma and related molecular mechanism research - graduation thesis of internal medicine ( d.docx

博士学位论文的关系，利用回归分析分析了PBLD对肝癌患者预后的预测价值，同时，利用Kaplan-Meier法分析PBLD与肝癌患者生存、无瘤生存时间的关系。PBLD与肝癌患者预后的关系进一步由另一独立队列进行验证。2．体外检测PBLD对肝癌细胞株生物学行为的影响(1)PBLD对肝癌细胞增殖的影响为研究PBLD对肝癌细胞株增殖能力的作用，我们首先利用细胞转染技术过表达或者沉默肝癌细胞株中PBLD的表达。利用CCK．8法将稳定过表达PBLD的HepG2PBLD和Huh7PBLD细胞及其相应的空载对照细胞以相同的数量分别接种于96孔板中，待细胞贴壁后每隔24小时随机选取5孔进行CCK．8检测，连续检测至72小时。同时，我们将HepG2 PBLD和Huh7 PBLD及其对应的空载对照细胞分别接种于10cm培养皿中，14天后进行染色、计数分析，利用平板克隆观察PBLD过表达后对肝癌细胞株增殖能力的影响。(2)PBLD对肝癌细胞侵袭、迁移能力的影响。为研究PBLD对肝癌细胞株侵袭和迁移能力的作用，将等量的HepG2 PBLD和Huh7PBLD及其空载对照细胞分别接种于含有基质胶和无基质胶的transwell小室中，48小时后结晶紫染色、计数，利用transwell小室观察PBLD过表达后和敲低后肝癌细胞株侵袭(含基质胶)、迁移(无基质胶)能力。(3)PBLD对肝癌细胞株细胞周期分布的影响。为明确PBLD过表达所引起的肝癌细胞株增殖抑制作用是否与细胞周期相关，我ff]；FU用PI染色分别对HepG2PBLD和Huh7PBLD及其对应的空载对照细胞进行DNA标记，进而利用流式细胞技术对两组肝癌细胞的周期分布进行分析，并与空载细胞进行对比，分析PBLD过表达对肝癌细胞株细胞周期分布的影响。3．体内检测PBLD对肝癌细胞株增殖、血管生成能力的作用(1)PBLD对肝癌细胞增殖能力的作用：4-6周BALB／c雄性裸鼠在随机分为PBLD过表达细胞组和空载对照细胞组。分别将等量PBLD过表达的稳转细胞和万方数据中文摘要对照细胞注入裸鼠皮下，观察并测量皮下移植瘤的生长直径来检测PBLD对肝癌细胞增殖的作用。(2)PBLD对肝癌细胞血管形成能力的影响：取裸鼠皮下成瘤组织，固定、脱水、包埋后进行免疫组织化学检测血管内皮标志性指标CD3l的表达，并镜下计数不同细胞来源的肝癌组织中微血管的形成数量来分析PBLD对肝癌细胞血管形成能力的影响。4．PBLD发挥生物学作用的分子机制研究(1)PBLD下游基因的筛选：通过真核表达载体转染构建PBLD过表达HepG2稳转细胞株，运用基因组学技术筛选并分析PBLD过表达后与空载对照细胞之间的差异基因谱。(2)PBLD下游靶基因及相关信号通路的初步筛选：通过对所有差异基因进行功能聚类及富集分析，筛选出PBLD潜在的下游靶基因及可能调控的信号通路。(3)PBLD对相关信号通路调控的验证：1)PBLD对肝癌细胞EMT通路的影响利用细胞免疫荧光检测PBLD过表达细胞株中上皮细胞标记物E．cadherin及间质细胞标记物N．cadherin的表达，western．blot检测裸鼠皮下成瘤组织中两者的表达。同时，利用western．blot分别检测PBLD过表达和沉默后肝癌细胞株中EMT相关指标的变化。最后，在82例肝癌标本中对PBLD和E．cadherin的表达水平的关系进行验证。2)PBLD对ERK／MAPK信号通路的影响利用ERK通路抑制剂U0126抑制ERK／MAPK信号通路活性，检测pERK的表达情况，进而对添加U0126的肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的变化情况进行检测。3)PBLD对HIFla／VEGF．A的影响IV万方数据博士学位论文利用细胞免疫荧光检测PBLD过表达细胞株中VEGF．A的表达变化，利用cck8法检测在VEGF对PBLD过表达细胞株增殖能力的影响，进一步利用western．blot 技术检测常氧和缺氧条件下PBLD对肝癌细胞中VEGF和及其上游调控因子HIFlot表达水平的影响。结果1．PBLD在肝癌组织中的表达存在显著降低或缺失本研究中免疫组织化学染色和westernblot检测发现肿瘤组织PBLD较对应的癌旁正常肝组织表达显著下降；实时荧光定量PCR检测发现108例肝癌患者中有92例患者(84．4％)肝癌组织中PBLDmRNA的表达水平存在不同水平的降低，肝癌组织中的平均表达水平显著低于癌旁组织(尸0．001)。同时，随肝癌组织的分化程度的降低PBLD表达水平逐渐降低。2．PBLI)的表达水平与肝癌患者的预后显著相关PBLD的表达水平与肝癌患者临床特征及预后的关系显示：PBLD的表达水平与肝癌组织的分化程度(P=0．017)及肿瘤的AJCC分期(P=0．038)密切相关，PBLD表达水平越高，肝癌组织