副球菌w10173s-酰胺酶的分离纯化及其酶学性质研究-purification and characterization of s - amidase from paracoccus w 10173.docx

摘要摘要酰胺酶可以将酰胺水解生成对应的羧酸和氨，其中的立体专一性酰胺酶能专一性水 解某种对映体酰胺，是一种极有前途的用于获取手性酰胺及其衍生物的工具。本实验室 筛选得到的副球菌 W10173 产生的(S)-酰胺酶能够立体选择性水解(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺 中的(S)-哌嗪-2-甲酰胺生成重要医药中间体哌嗪-2-羧酸的单一对映体。本研究首先对副球菌 W10173 的(S)-酰胺酶分离纯化方法进行了研究。通过对超声 波破碎条件、盐析条件、DEAE-52 离子交换洗脱条件进行探索，确定了超声波最佳破碎 条件为功率 400 W，工作时间 3 s(间歇时间 6 s)，循环 270 次；盐析最佳硫酸铵饱和度 范围为 20 %-60 %，且重复三次；DEAE-52 离子交换层析洗脱液最佳 pH 为 7.0，流速为 250 mL/cm2/hr，洗脱液依次为 c(NaCl) 0.25 mol/L 100mL、c(NaCl) 0.275mol/L 60 mL、c(NaCl)0.30 mol/L 60 mL、c(NaCl) 0.325 mol/L 60 mL、c(NaCl) 0.35 mol/L 60 mL、c(NaCl ) 0.375 mol/L 60 mL。最后，(S)-酰胺酶纯化倍数为 428.3。经 SDS检测最终酶蛋白分子量约为37.6 kDa。为建立该(S)-酰胺酶游离酶的最适作用条件，进一步对其酶学性质进行了研究，确 定了 pH、温度、金属离子、EDTA-Na2、尿素等对酶活的影响。通过测定在不同 pH、 不同温度下(S)-酰胺酶酶活，确定了该(S)-酰胺酶的最佳起始 pH 为 9.0、最佳反应温度为 37 ℃。同时还发现酶对环境 pH 较为敏感，pH 小于 9 或大于 10.5 都会导致酶活的迅速 下降。通过对酶在 40 ℃、60 ℃、80 ℃各 5 h、10 h、15 h、20 h 后残留的酶活进行测定 发现，该酶具有一定的温度稳定性，40 ℃条件下 20 h 后仍能保留近 50 %的活性。不同 金属离子对酶活的影响差异显著，1 mmol/L 或 10 mmol/L 的 Ca2+，Zn2+、Ag+、Pb2+、 Na+都能较强的抑制(S)-酰胺酶酶活，甚至 1 mmol/L 的 Ca2+, Zn2+ 或 Ag+几乎完全抑制(S)- 酰胺酶；而 1 mmol/L 或 10 mmol/L 的 Co2+, Fe3+, Mn2+, Mg2+能明显激活该酶酶活，10 mmol/L Mn2+存在的条件下(S)-酰胺酶酶活大约是原酶液的 2.9 倍。尿素对酶的活性没有 影响。螯合剂 EDTA-Na2 的存在能够抑制(S)-酰胺酶酶活，说明该(S)-酰胺酶在催化过程 中有金属离子参与。关键词副球菌(S)-酰胺酶分离纯化酶学性质AbstractAbstractAmidase, which catalyzes the hydrolysis of amides to the corresponding acids and ammonia, is a promising synthesis tool for chiral amides and related derivatives. The (S)-amidase produced by Paracoccous sp. W10173, which was screened by our lab, can transform (R,S)-piperazine-2-carboxamide to yield S-piperazine-2-carboxylic acid stereoselectively. Thus it can be used in the producting of important drug intermediates of piperazine-2-carboxylic acid single enantiomers.Firstly, the study on isolation and purification methods of the (S)-amidase of W10173 were carried out. The ultrasonic treatment, salting out, and ion exchange chromatography conditions of (S)-amidase from W10173 were explored and established preliminary. The optimal ultrasonic treatment conditions were determined at the output power of