共振光散射技术在蛋白质分析中的研究及其应用-research and application of resonance light scattering technology in protein analysis.docx

仪器和试剂岛津 RF-540 型荧光分光光度计（日本岛津）； pHS-4C+型酸度计(成都 方舟科技)；UV-265 型紫外可见分光光度计（日本岛津）；FA1004A 型电子 天平（上海新诺仪器设备有限公司）；BSA 储备液:牛血清白蛋白(BSA,中国联星实业有限公司)用二次蒸馏水 溶解并定容，浓度为 50 μg/mL,并于 4℃下保存。藻红溶液(1.0×10-3 mol/L)； Britton-Robinson(BR)缓冲溶液；氯化铜溶液（1.5×10-3 mol/L）；1 mol/L 的 NaCl 溶液;所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。实验方法在 10 mL 的具塞比色管中依次加入 1.5 mL pH 3.78 的 BR 缓冲溶液， 1.2 mL 藻红溶液，0.5 mL 氯化铜溶液以及一定量的蛋白质标准溶液或样品 溶液，用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀。10 min 后，在荧光分光光度计上选 择 λex=λem，激发和发射狭缝宽度均为 10 nm，进行同步扫描，得到 RLS 光谱；在 RLS 峰 338 nm 处测定得体系的 IRLS。用紫外可见分光光度计测定 体系的吸收光谱。2.3 结果与讨论2.3.1 体系的共振光散射光谱和电子吸收光谱图 2-1 为体系的共振光散射光谱图。由图 2-1 知，单一的 BSA（曲线 a）、 藻红-Cu(Ⅱ)配合物（曲线 b）的 IRLS 都较弱；藻红与 BSA 结合后 IRLS（曲 线 c）较强；但是藻红-Cu(Ⅱ)配合物与 BSA 结合后（曲线 d）最强；在 338 nm 处出现明显的共振光散射峰，故选择 338 nm 处为 BSA 的工作波长。图 2-2 为体系的电子吸收光谱图。由图 2-2 知，蛋白质溶液在 325 - 625 nm 波长范围内对光没有吸收（曲线 a）；曲线 b、c、d 在 526 nm 处有一吸 收峰，且在 338 nm 处，体系对光的吸收微弱，处于吸收峰的波谷；但在 338 nm 处出现了明显的共振光散射峰。说明实验事实与共振光散射理论相符。600550d500450400cRLS350I300b25020015010050a0250300350400450500550?/nm图 2-1共振光散射图a- 2 mL BSA+1.5 mL B-R;b- 0.5 mLCu2++1.2 mL 藻红+1.5 mL B-R;c -a+1.2 mL 藻红;d- b+2 mL BSA0.40d0.350.30b0.25cA0.200.150.100.050.00a350400450500550600?/nm图 2-2电子吸收光谱a- 2 mL BSA+1.5 mL B-R;b- 0.5 mLCu2++1.2 mL 藻红+1.5 mL B-R;c- a+1.2 mL 藻红;d- b+2 mL BSA2.3.2实验条件优化2.3.2.1反应酸度的选择按实验方法，以 BR 缓冲溶液调节溶液的酸度，测定不同 pH（1.81—4.56） 值下的 RLS 强度（如图 2-3）。如下图所示，当溶液的 pH 值为 3.78 时，体 系的 RLS 强度最大；当溶液的 pH 值在 1.81—3.78 之间时，藻红-Cu(Ⅱ)配 合物与 BSA 相互作用产生的共振光散射强度逐渐增加；当溶液的 pH 值超 过 3.78 时，藻红-Cu(Ⅱ)配合物与 BSA 相互作用产生的共振光散射强度明显减弱。因此，实验选用 BR 缓冲溶液的 pH 值为 3.78。1406.251250.00IRLS1093.75937.50781.251.52.02.53.03.54.04.55.0pH图 2-3 pH 的影响按实验方法，在选定的最佳酸度值的实验条件下（pH=3.78）改变缓冲 溶液的用量进行实验。依次加入 BR 缓冲溶液的用量为 0.2、0.4、0.6、0.8、 1、1.2、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mL，得到不同 RLS 强度（如图 2-4）。实验发 现，当缓冲溶液的用量为 1.4 mL 时，体系 IRLS 达到最大且基本保持不变。 所以，实验选用缓冲溶液的用量为 1.5 mL。1201059075IRLS604530150.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.2mL图 2-4 缓冲溶液用量对体系 IRLS 的影响2.3.2.2 藻红用量对体系 RLS 强度的影响按实验方法，选定缓冲溶液用量为 1.5 mL、pH=3.78，实验选用藻红浓 度为 1.0×10-3 mol/L，依次加入藻红用量为 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、 1.6 和 1.8 mL，考察了不同藻红用量对体系 RLS 强度影响（如图 2-5）。如图 所示，藻红用量小于 1.2