基于多聚螯合物酶催化放大效应的电化学免疫分析方法分析-analysis of electrochemical immunoassay method based on polymerase chain reaction amplification effect.docx

基于多聚螯合物酶催化放大效应的电化学免疫分析方法研究摘要本论 文 采用 EnVision 试剂 为 基础 ， 制备 信号 探 针 ，进行信号 放大 。 本 论文 主要 从 纳 米 金 属 标 记 信号探针 的 制 备 、 免 疫 传 感 器 的 构 建 和 信 号 放 大 等 方 面 开 展了以下 三个方 面的 研究 工作 ：1. 基于 EnVision 信 号探针测定甲胎 蛋白 的超灵敏 电化学 免疫 传感器EnVision 试剂(EV)是 葡聚 糖 -酶 -抗抗 体 复 合物 ， 含有 大 量的 辣 根过 氧 化物 酶 (HRP)和 抗抗体 。本 文采用 EV 结 合甲胎 蛋白第二 抗体作 为 信 号探针测 定甲胎 蛋 白。 首先 ， 在 金 电 极 表 面 电 沉 积 一 层 纳米金 ， 由 于 纳 米 金 优 良 的 特 性 ， 可 以 较 好的保持抗体等生物分子的活性。 再将硫醇化 G 蛋白固定至修饰电极表面，用 于定向 固定 甲胎蛋白 抗体， 通过抗原 -抗 体 的 特 异 性 结 合 反应 在电极界面形成 夹 心型 免 疫 复 合 物 ， 制 备 成 一 种 灵 敏 的 电 化 学 免 疫 传 感 器 ， 并 详 细 的 研 究 了 该 电 化学 免 疫传 感 器的 性 能。 EV 试剂的 使用 ，使 得 电流 响 应大大 增强 ， 从而 提 高电 化 学 免 疫 传 感 器 的 灵 敏 度 和 降 低 它 的 检 测 下 限 。 该 免 疫 传 感 器 的 线 性 范 围 为 5~200 pg mL-1，线性 相关系数 为 0.998， 检出下限 达到 2 pg mL-1(信噪 比为 3)。 将该 免 疫传 感 器用 于 病人 的 血清 样 品分 析 ， 所 得 结果 与 ELISA 法相 对照， 两种 方法所测 结果 相 差 不 大 ， 表明 研 发 的 免 疫 传 感 器 在 临床 检测 分析 具有 很 大 的 潜 在应用价 值。2. 基于 纳米金 标记 EnVision 信 号探针 检 测牛奶中 己烯雌 酚 的 免温育电 化学免 疫 传感器信 号放大 研究本 文 研 究 了 一 种 富 酶 型 检 测 己 烯 雌 酚 (DES)的 电 化 学 免 疫 传 感 器 。 首先，在 电 极 表 面 修 饰 一 层 聚 二 烯 丙 基 二 甲 基 氯 化 铵 (PDDA)， PDDA 带 正 电 ， 能 够 很 好 的与 电沉积 至 电 极 表 面 带负电的 纳 米 金 通 过 静 电 结 合 ， 由 此 构 建 免 疫 传 感 器 界 面。 其 次 ，信 号 探针 制备 时 使用 伴 刀 豆球 蛋白 A(Con A)，可 以在 纳 米金 上 定向 固定 EV， 增加 信 号 探针 酶 的密 度 ，从 而 进 一 步 放大 信 号。 由 于己 烯 雌酚 的 对称 结构，采 用夹心 免疫 反应模式 ，将 纳米金标记 EV 固定 至修饰 电极表面 ，形成 夹 心免疫复合物， 测定 夹心 免疫 复合物 中 HRP 催化过氧化氢 (H2O2)对氯 化血红素 的 氧 化 还 原 反 应 所 产 生 的 电流 。 通 过 电 流 的 变 化 量 来 定 量 己 烯 雌 酚 。 由于 纳米 I金标记 EV 的信 号探 针上负载 有大量的 HRP 和抗体，大大 增强了免疫 传感器 的响应信号 。该免 疫传 感器实现 了 浓度 在 5~500 pg mL-1 范 围内 的高灵敏 检测， 分 别在低浓 度和高 浓度 呈线性增 长 ，线 性相 关系数为 0.999， 检 测下限达 2 pg mL- 1(信噪 比为 3)。该 免 疫感 器用于牛奶样 品 分析 ，检 测结 果与 ELISA 方法 相比 ， 具有有很 好的相 关性 ，有望应 用于 牛奶中 其它有机 污染残 留 物 的检测分析。3. 基于 β -环糊精修饰电极和 纳米 铂标记 EnVision 信 号 探 针 的 三 重 信 号 放 大 电 化学免疫 分析方 法研究 本文 研究了基于 β-环糊 精 修 饰 电 极 的 超 灵 敏 电 化 学 免 疫 传 感 器 。 将 纳 米 铂 (PtNPs)和 己烯雌 酚抗 体 (DES Ab)共同固 定 在 EV 上，制得 EV/PtNPs-DES Ab 信 号 探 针 。 β-环 糊 精 修 饰 电 极 用 于 捕 获 DES， 通 过 夹 心 免 疫 反 应 ， 将 信 号 探 针 固 定 至 电 极 表 面 。 免 疫 复 合 物 中 PtNPs 和 HRP 共 同 催 化 H2O2 产 生 氧 化 还 原 电 流，通过电流变化 值 来定量 DES。 因 此 ， 在 前一部分 实验 的 基 础 上 ， 进 一 步 构 建了一