DNA分子标记技术在龙胆鉴别与亲缘关系划分上应用.doc

DNA分子标记技术在龙胆鉴别与亲缘关系划分上应用 　　摘要：研究东北产药材龙胆的鉴别方法及其亲缘关系，用分子生物学技术对东北产药材龙胆的3个不同品种进行了DNA提取和RAPD及ISSR分析。应用RAPD法从80个随机引物中找出了3种引物(S-76,S-69,S-64)来标记3种龙胆发现这3种引物能把供试的3种龙胆全部区分开。同时应用ISSR法从7个引物中筛选出4个引物能扩增出稳定遗传多态性引物，共扩增出44条DNA条片段，其中同源片段有22个，特异片段有12个，多态片段为10个。用这些引物扩增出的指纹图谱进行聚类分析，得出了相同的结论，即在3种龙胆中，条叶龙胆，龙胆亲缘关系较近，三花龙胆与二者亲缘关系较远。结果表明分子标记技术可用于龙胆的鉴别，亲缘关系划分。? 　　关键词：龙胆；亲缘关系；分子标记；中药鉴定? 　　中图分类号：R282.710.3 　　文献标识码：A 　　文章编号：1673-7717（2007）04-829-02 　　分子标记是上世纪80年代产生的以DNA的多态性为基础的遗传标记。分子标记技术不受环境因素、个体发育阶段及组织部位影响，多态性强，准确率高，是生物分类学，遗传育种学等研究重要的工具。其中随机扩增的多态性DNA（Random Amplified Poly morphic DNA,RAPD）和ISSR（Inter Simple Sequence Repeats）技术又称简单重复序列区间扩增，已广泛应用于物种的基因型鉴定?[1]、品种的保护鉴定?[2-3]、多样性研究?[4-5］、辅助选择育种?[6]、中药的鉴别?[7-8]等领域。? 　　《中华人民共和国药典》收录的中药龙胆为龙胆科植物龙胆Gentiana scabra Bunge、三花龙胆G. triflora Pall、条叶龙胆.G. manshurica Kitag或坚龙胆.G. rigescens Franch.的干燥根。前3种龙胆主产于东北。笔者对3种东北产药材龙胆的基因组DNA进行RAPD和ISSR分析以鉴别它们种间亲缘关系。现将初步结果报道如下。? 　　 　　1材料试剂与仪器? 　　 　　药材：条叶龙胆.G. manshurica Kitag、龙胆Gentiana scabra Bunge、三花龙胆G. triflora Pall由哈尔滨师范大学实验基地提供，哈尔滨师范大学生物系植物教研室王臣教授鉴定。仪器：PCR仪（日本#8226;株氏会社杭州大和热磁电子有限公司Life Express基因扩增仪）。主要试剂：RAPD和ISSR引物为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。 Tag DNA聚??酶、dNTP、10×Buffer为上海博亚生物技术有限公司的产品。琼脂糖购自Gene公司。? 　　 　　2实验方法? 　　 　　2.1改进的CTAB法提取龙胆中的总DNA将3种龙胆的根粉碎后，分别取0.5g加入2 %的CTAB抽提缓冲液6mL，迅速用力研磨。然后水浴保温30min。加入等体积酚和氯仿―异戊醇混合液（24∶1）少量，混匀，4℃下10000r/min离心10 min。上清液取出，加等体积酚和氯仿和异戊醇混合液（24∶1）少量：4℃下10000r/min离心10 min。上清液加入等体积氯仿－异戊醇混合液（24∶1）重复抽提1次，4℃下10000r/min离心10 min。同上步抽提1次并离心，上清液转入1.5mL离心管中，加入1／10体积的5moL醋酸钾150～200μL，及2倍体积95％乙醇，轻微混匀后于－20℃条件下沉淀30 min。4℃下10000r/min离心10min。沉淀即为基因组DNA。再用70%乙醇洗涤2次，用无菌滤纸吸干，无菌风下吹干。加适量TE缓冲液溶解，－20℃冰冻保存。? 　　2．2RAPD扩增及检测扩增反应总体积为25μL，其中含20ng总DNA，2μL10×PCR Buffer, 2.5μL,2mmoL 4×dNTP 2.5μL，0.2μmoL随机引物1μL,Taq酶(1.5U/25μL) 0.3μL,灭菌的ddH2O补充到25μL。扩增程序：94℃,3min，一个循环；94℃，30s，36℃，1min，72℃，2min，40个循环，终反应72℃，10min。扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，用凝胶成像系统进行分析。? 　　2. 3ISSR扩增及检测扩增反应总体积为25μL，其中含20ng总DNA,2μL10×PCR Buffer , 2.5μL,2mmoL4×dNTP 2.5μL，0.2μmoL随机引物1μL ,Taq酶(1.5U/25μL) 0.3μL ,灭菌的ddH2O补充到25μL。扩增程序：94℃ 90s，94℃ 40s，45℃ 1min ,72℃ 1