利用全内反射荧光显微镜对DNA轮回反应网络进行可视化观察.pdf

利用全内反射荧光显微镜 对DNA循环反应网络进行可视化观察 摘要 在本研究中，我们建立了几种基于DNA循环反应的分子机器，进行信号的 放大以降低对溶菌酶的检测限，并利用全内反射荧光显微镜来研究分子机器运行 的机制。研究表明，我们设计的两种分子机器都能在三个层次上放大检测信号， 利用全内反射荧光显微镜可以从单分子层面上，对DNA分子机器进行可视化观 察研究。 第一章介绍了相关领域的发展背景。主要阐述了在单分子层面的研究及其在 国内外领域的研究进展，阐述展望了全内反射荧光显微镜的原理，和它在生命科 学中的应用，介绍了几种扩增DNA片段的方法和滚环复制的相关原理和应用， 简述了溶菌酶、DNA分子机器方面的研究进展。由此引出课题的提出：利用DNA 循环反应网络放大信号并用全内反射荧光显微镜进行可视化观察。 第二章建立了一个以靶识别片段、一个信号片段和一个具有局部剪切位点的 片段构成的DNA探针，由适体特异性识别溶菌酶引发一个由三级信号放大系统 构成的DNA循环反应网络，以此方法检测溶菌酶，可以大大降低其检测限。 此反应体系由适体识别溶菌酶引发的滚环复制反应作为基础放大，滚环复制 放大法反过来触发靶替换聚合反应，在这个反应里溶菌酶能被循环利用，因此滚 环复制不断重复，产生另一层次的放大，即滚环复制反应的放大；另一方面，靶 替换聚合反应诱发剪切聚合循环，在这个循环里不断产生单链DNA，使滚环复制 进一步重复，带来更深层次的放大效果。该系统不仅可以实现DNA片段的扩增， 并能实现核酸和生物大分子间的替换。 第三章研究了对中间产物是短核酸链的DNA分子机器的直接荧光成像，直 接观察滚环复制反应的引发和循环反应。本研究中涉及靶替换聚合，靶与适体连 接，在DNA聚合过程中运用适体序列做模板，靶于是被替换掉。研究中还涉及 ltamar Wiilner研究小组发明的聚合剪切循环，双链DNA能在特订的剪切位点被 相关的剪切酶(NEase)剪切，剪切的位点又可作为靶替换聚合的起点，引发产生一 系列的单链DNA和其互补的部分。 我们所设计的分子机器的原始反应物，是尺寸为纳米级的DNA纳米结构或 DNA链，在荧光显微成像里通常表现为单个的亮点；而将产物设计成与反应物有 明显区别的形状(长线状)，那么就可以在荧光显微图像中将其和原料物区分开 来，从而实现对DNA反应网络的成像表征。 关键词：滚环复制全内反射荧光显微镜单分子溶菌酶DNA分子机器 VISUALIZATIONOFTHE RECYCLED ROLLINGCIRCLE POLYMERIZATIONIN ACYCLING REACTIONSYSTEM WITHTOTAL INTERNAL REFLECTION MICROSCOPY AB STRACT Inthis DNA-related study，a reaction network，inwhich circle rolling was polymerizationand recycled establishedtoenhancethe repeated，was sensitivity of the lysozymedetection，and ofthis