基因工程-第四章 基因工程过程.ppt

第四章 基因工程过程 转化的原理与技术 细菌转化的全过程包括五个步骤： (1)感受态的形成。典型的革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚，形成感受态时细胞表面发生明显的变化，出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质(如细菌溶素)的合成，使细菌膜壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等； (2)转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA、双链RNA以及DNA—RNA杂交双链都不能结合在膜上， (3)转化因子的吸收。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中，这个吸收过程为EDTA所抑制，可能是因为核酸酶活性需要二价阳离子的存在； (4)整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种膜内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处； (5)转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。 革兰氏阴性细菌细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，供体DNA进入受体细胞的转化机制还不十分清楚。革兰氏阴性细菌在感受态的建立过程中伴随着几种膜蛋白的表达，它们负责识别和吸收外源DNA片段。研究表明，嗜血杆菌和奈氏杆菌均能识别自身的DNA，如嗜血杆菌所吸收的自身DNA片段中都有一段11bP的保守序列5’AAGTGCGGTCA3’。这表明革兰氏阴性细菌在转化过程中对供体DNA的吸收具有一定的序列特异性，受体细胞只吸收它自己或与其亲缘关系很近的DNA片段，外源DNA片段可以结合在感受态细胞的表面，但极少能吸收。与革兰氏阳性菌不同，嗜血杆菌和奈氏杆菌等革兰氏阴性细菌的DNA是以完整的双链形式被吸收的，在整合作用发生之前，进入受体细胞内的双链DNA片段与相应的DNA结合蛋白结合，不为核酸酶所降解，DNA整合同样发生在单链水平上，另一条链以及被取代的受体菌单链DNA则被降解。 将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca 2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶(DNase)的羟基—磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。 1983年，Hanahan除了用MgCl2与CaCl2 处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜(DMSO)和二硫基苏糖醇(DTT)进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。 目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆苗、葡萄球菌以及其他一些革兰氏阴性菌的转化。 以λ—DNA为载体的重组DNA分子,由于其分子量较大，通常采取转染的方法将之导入受体细胞内。在转染之前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使之成为具有感染活力的噬菌体颗粒。用于体外包装的蛋白质可以直接从大肠杆菌的溶原株中制备，现已商品化。这些包装蛋白通常分成分离放置且功能互补的两部分，一部分缺少K组分，另一部分缺少D组分。包装时，只有当这两部分的包装蛋白与重组λ—DNA分子三者混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装溶液被重组分子污染后均不能包装成有感染活力的噬菌体颗粒.这种设计也是基于安全考虑. 整个包装操作过程与转化一样简单：将λ—DNA与外源DNA片段的连接反应液与两种包装蛋白组分混合，在室温下放置lh，加入一滴氯仿，离心除去细菌碎片，即得重组噬菌体颗粒的悬浮液。将之稀释合适的倍数．并与处于对数生长期的大肠杆菌受体细胞混合涂布、过夜培养即可用于筛选与鉴定。 原核细菌的转化虽是一种较为普遍的遗传变异现象，但是目前仍只是在部分细菌的种属之间发现，如肺炎双球菌、芽泡杆菌、链球菌、假单抱杆菌以及放线菌等。而在肠杆菌科的一些细菌间很难进行转化，其主要原因是一方面转化因子难以被吸收，另一方面受体细胞内往往存在着降解线状转化因子的核酸酶系统。另外，细菌自然转化是自身进化的一种方式，通常伴随着DNA的整合，因此在DNA重组的转化实验中，很少采取自然转化的方法，而是通过物理方法将重组DNA分子导入受体细胞中，同时也对受体细胞进