《遗传学》10.基因工程.ppt

第十章 基因工程;本章重点及难点： 基因工程工具酶 表达载体构建 遗传转化方法;第一节 基因工程的概念 一、遗传工程的概念 细胞工程：体细胞融合、体细胞诱变 染色体工程：不同物种间转移转移个别染色体 、染色体片段甚至完整染色体组 细胞器工程：不同物种间转移细胞器 基因工程(DNA重组技术）：不同物种间转移 个别基因。 专指基因工程：按照预先涉计好的蓝图 ，借助实验室技术，将一种生物的某个基因转移到另 一生物中，并使后者定向获得新的遗传性状。 ;二、基因工程的一般步骤;第二节 工具酶及目的基因 基因工程中常用的工具酶主要有： ;一、限制性内切酶 是细菌细胞体内的一种水解DNA的磷酸二 酯酶，是基因工程中最重要的工具酶。 外源DNA入侵后被这种酶识别并降解，抵 御外源遗传信息侵入。称为限制。 修饰本身或外源DNA得以继续保留。 主要有两大类： I类：以大肠杆菌B菌株产生的EcoB和大肠杆菌K 菌株产生的EcoK为代表。切割DNA时需要ATP、 Mg＋＋、S－腺苷甲硫氨酸，可切割DNA的任何部 位，产生平齐末端。 ;II类：以大肠杆菌质粒产生的EcoRI和嗜血杆 菌产生的HindⅢ为代表。切割DNA时只需要Mg＋＋ 。这是最重要的基因工程酶。 II类酶特点： 1.专一性 只作用于特定的核苷酸序列，回文序 列。 EcoRI切点： 3’－C－T－T－A－A－G－5’ 5’－G－A－A－T－T－C－3’ ;HindⅢ切点： 3’－A－A－G－C－T－T－5’ 5’－T－T－C－G－A－A－3’ 2.产生粘性末端 EcoRI粘性末端 3’－C－ T－T－A－A－G－5’ 5’－G－A－A－T－T －C－3’ HindIII粘性末端 3’－A－ A－G－C－T－T－5’ 5’－T－T－C－G－A －A－3’;二、目的基因的获得 1. 人工合成 蛋白质→mRNA→DNA。 最早是考兰纳1970年合成的编码酵母苯丙氨 酸DNA，由77个核苷酸对组成。 2.自然分离 这是目前最成功、最常用的方法 鸟枪射击法(散弹枪法）。 （1）基因文库的构建 将生物体的全基因组用多种内切酶酶解成大小不 等的片段，分别与载体结合形成重组DNA分子，导入 细菌细胞，经无性繁殖（克隆）形成菌落群，该菌落 群包含了生物的全部基因，称为基因文库。 ;;2. 钓取目的基因 利用限制性内切图谱、核酸分子杂交、核酸序 列分析、PCR扩增等方法鉴定分离基因 进 一步进行基因功能验证和表达研究 获得目 的基因。 ;第三节 载体构建 载体：将目的基因导入受体细胞的运载工具。 目的基因＋载体 重组DNA分子 受体细胞 载体需具备的条件： （1）?在寄主细胞内能自我复制，稳定保存。 （2）?有标记性状，便于鉴定选择。 （3）?有多种内切酶的切点，每种酶的切点只有一个，切割后不损害复制和标记功能，并能嵌入外源DNA片断。 ;1．细菌质粒 环状双链DNA分子，现在已商 品化。 如pUC质粒系列载体。具有α－互补显色表现 型。即指来自质粒DNA的 lacZ酶（β－半乳糖 苷酶）N端的一段氨 基酸残基（α-肽） 与α-肽缺失的lacZ 酶混合后能恢复 lacZ酶的活性。 ; 如将pUC18质粒转入带有lacZ基因a - 肽缺失的受体细菌细胞后，在含有5-溴-4-氯-3-引哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-galactopyranoside, X-gal)及异丙基－β－D硫代半乳糖苷（IPTG）的培养基上，质粒产生N端的146个氨基酸，受体细菌细胞产生C端的氨基酸，经a - 互补可产生有功能的lacZ酶，水解X-gal产生一种蓝色物质，附着于