双探针FQ-PCR法检测乙型肝炎病人YMDD变异.docVIP

双探针FQ-PCR法检测乙型肝炎病人YMDD变异 　　[摘要]目的:研究乙型肝炎病人的YMDD变异情况。方法:采用双探针实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对46例HBV-DNA阳性的标本进行YMDD变异株的检测,其中未进行抗病毒治疗的20例样本,进行抗病毒治疗26例。结果:在26例抗病毒治疗的标本中检测出YMDD16例,在未经抗病毒治疗20例标本中检测出YMDD2例。这两组患者之间YMDD变异有显著性差异(P 　　[关键词]肝炎,乙型,慢性;YMDD突变;聚合酶链反应 　　[中图分类号]R512.6 　　[文献标识码]A 　　[文章编号]1006-1959(2009)11-0019-02 　　拉米夫定是国际公认的对乙型肝炎病毒(HBV)具有确切疗效的抗病毒药物之一,其临床应用日益广泛[1、3],但在应用中不断有病毒变异的发生,这可能是引起治疗失败或病毒对治疗无反应的原因[4]。对发生变异的患者临床应及时调整用药[5]。由于目前缺乏简便、快速的HBVYMDD检测方法,从而不能将HBVYMDD的检测应用于常规以至于影响了临床的治疗。本研究针对这一情况,对HBVYMDD采用双探针实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative Polymerase chain reaction,FQ-PCR)来进行检测,从而为临床准确使用拉米夫定治疗乙型肝炎提供了有力的保证。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1 标本来源:2007年8月～2009年3月在南通市中医院进行FQ-PCR检测,HBV-DNA大于1×10?4的46例病人,其中未经过抗病毒治疗的20例,经过拉米夫定治疗一年至两年的26例。通过真空采集器采集空腹受检者静脉血3ml,在室温静置1h,4000rpm/分离心10min,分离血清;吸取血清置于1.5ml的离心管中,如在5日内测定,则标本放于4℃,如果测定时间延长,标本存于-20℃。 　　 　　1.2 仪器与试剂:美国MJ公司的option○RII实时荧光定量PCR分析仪。含FAM标记的通用HBV-DNA探针和HEX标记针对HBV-DNAYMDD变异的特异性探针的双探针PCR反应液(由上海申友公司合成)、Taq酶、HBV-DNA裂解液、DNA(YMDD)标准品、DNA浓缩液。 　　 　　1.3 方法 　　1.3.1 试剂准备:试剂在室温完全解冻并充分混匀及短暂离心后开管。配制:按每个反应取HBVPCR(或HBVPCR)反应液20ul、酶1ul计算,乘以所需的反应管数(HBVYMDD不需标准管),加入到一种无菌离心管中,振荡混匀。分装:用微量加样器在每一个PCR反应管内加入21ul上述混匀的反应液,存??4℃。 　　1.3.2 样本处理:取待测血清50μL(临界对照、阳性对照、阴性对照与样本一样处理),加到0.5mL离心管中:加人50μLDNA浓缩液,混匀振荡后4℃静置5min,15000r/min离心10min,吸弃上清。加入20μL裂解液,剧烈振荡至无沉淀后短暂离心,100℃干浴10min;15000r/min离心5min,取上清液备用。 　　1.3.3 加样:在上述准备的装有混合反应液的PCR反应管中加入标准品、标本、临界对照、阳性对照、阴性对照的DNA各4μL。 　　1.3.4 扩增:42℃5min,94℃5min,再按94℃10s,55℃30s,读板,72℃40s,40个循环;最后25℃5min保温。选定检测荧光为FAM、HEX通道。 　　1.3.5 阈值设定:以刚好高于阴性的扩增曲线最高点,且阴性对照品CT=40或CT=0为原则,调整起始阈值。 　　1.3.6 计算结果:option○RIIFQ-PCR分析仪根据输入的标准品数值、基线和阈值用Lightcycler软件自动计算出定量结果。 　　1.3.7 HBVYMDD突变的检测:根据HEX通道与FAM通道的CT差值(△CT)来进行判断:①如果二者之差≥10,则判定为完全野生株或YMDD突变株含量低于检出限。②如果二者之差10,则判定为YMDD和野生株共存且YMDD突变株呈弱势。③如果二者之差≤5,则判定为完全YMDD突变株或YMDD突变株呈优势。 　　 　　1.4 统计分析:用χ?2检验分析对抗病毒治疗组及未进行病毒治疗组的HBV-DNA的YMDD变异进行统计学分析。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 YMDD检测:FQ-PCR通过对DNA扩增过程中信号的连续监控,从而实现对DNA位点突变的检测。HEX探针设计横跨预计的突变位点;未发生突变的DNA模板由于与探针之间存在单个碱基不匹配造成结合能力下降,导致了荧光信号的降低;而发生位点突变的DNA模板与YMDD探针相匹配荧光信号正常