第四章 酶分子修饰1.ppt

4.6.4 酶分子定向进化的选择策略 定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。 1、突变基因文库的构建 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 质量要求：文库包容性和文库完整性 过程： 载体选择 基因重组 形成基因文库 质粒 噬菌体DNA 黏粒载体 噬菌粒载体 转化 转导 2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术 平板筛选技术 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法 举例 例1：定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力 例2：大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究 例3：采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化 酶 性　　质 突变方法 枯草杆菌蛋白酶E 有机相活性/稳定性 易错PCR β-内酰胺酶 总活力/底物专一性 DNA改组 枯草杆菌蛋白酶BPN′ 稳定性 盒式诱变 对硝基苯酯酶 底物专一性/有机相活性 易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶 底物专一性 盒式诱变 β-半乳糖苷酶 底物专一性 DNA改组 绿色荧光蛋白 荧光 DNA改组 核酶 底物专一性 易错PCR/DNA改组 天冬氨酸酶 活性与稳定性 随机/定位诱变 药物和疫苗 活性/专一性/最佳表达 DNA改组 4.6.5 酶的体外定向进化应用实例 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 在酶学研究方面的应用 在医药方面的应用 在工业方面的应用 在抗体酶研究开发方面的应用 在核酸类酶人工改造方面的应用 在有机介质酶催化反应中的应用 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 1、在酶学研究方面的应用 酶活性中心的研究 酶的空间结构研究 酶的作用机制研究 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 2、在医药方面的应用 降低或者消除酶的抗原性 增强医药用酶的稳定性（半衰期） 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 3、在工业方面的应用 提高工业用酶的催化效率 提高工业用酶的稳定性 改变酶的动力学特性 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 4、在抗体酶研究开发方面的应用 诱导法 修饰法 氨基酸置换修饰 侧链基团修饰等 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 5、在核酸类酶人工改造方面的应用 核苷酸置换修饰 核苷酸残基修饰 4.7 酶分子修饰的应用（P152-157） 6、在有机介质酶催化反应中的应用方面的应用 增强酶的疏水性 提高酶活力 提高酶的稳定性 小 结 1、什么是酶分子修饰 3、酶分子修饰的基本要求和条件 4、酶分子的修饰方法 5、酶修饰后的性质变化 6、酶的定向进化 7、酶化学修饰的应用 2、化学修饰的原理 思考题 1、试述酶分子修饰的概念和作用。 2、何谓大分子结合修饰？有何作用？ 3、举例说明肽链有限水解修饰的作用。 4、何谓氨基酸置换修饰？有何作用？ 5、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。 6、酶分子的物理修饰有何特点？ 7、何谓酶定向进化？有何特点？ 8、简述突变基因定向选择的基本过程。 9、举例说明酶定向进化技术的应用。 * 上节课主要内容回顾 从酶的生产到酶的改性 酶分子修饰 所要解决的问题和修饰的目标 酶分子修饰的种类 侧链基团修饰 酶的改性（enzymic improving）：通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程。 酶改性的技术 酶分子的修饰 酶固定化 酶的非水相催化 酶的定向进化 …… 酶分子修饰 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 4.1 概述 2、酶分子修饰的原因 细胞外稳定性差； 酶活性不够高； 具有抗原性。 4.1 概述 4、酶分子修饰的目的 研究酶的结构与功能的关系。 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后） 提高酶的生物活性（酶活力）。 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 产生新的催化能力。 4.4 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰 氨基酸 侧链基团 修饰剂 Lys（赖） 氨基 三硝基苯磺酸，2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 Asp、Glu （天冬、谷） 羧基 碳化二亚胺 Arg（精） 胍基 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 C