临床基因诊断实验室 技术准入的缺陷分析.ppt

临床基因诊断实验室技术准入的缺陷分析 江苏省临床检验中心 许斌 我国医学实验室管理 国家实验室认可委员会（CNAS）： 依据-ISO 15189；国家认可；自愿 卫生部执业认证： 《医疗机构临床实验室管理办法》 为加强医疗机构临床实验室管理，提高临床检验水平，保证医疗质量和医疗安全，卫生部出台并决定自2006年6月1日起施行。《办法》包括总则、医疗机构临床实验室管理的一般规定、质量管理、安全管理、监督管理、附则等六章五十六条。 各省细则：《江苏省医院检验科建设管理规范》 省、市临床检验中心，强制，【体系+能力】 PCR实验室技术准入依据和标准 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》 卫医发[2002]10号 《临床基因扩增检验实验室工作规范》 卫检字[2002]8号 《临床基因扩增检验实验室现场技术验收表》 十章三十八款 缺陷一、防污染意识和措施 PCR 方法学/防污染 UNG/dUTP 系统 实验室分区原则 单一流向、明确的识别标记 各区仪器设备物品配备的充分性和科学性 防污染 分区 缺陷二、档案管理 仪器档案 （a）制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识； （b）仪器使用说明书或其复印件； （c）校准/检测的日期和结果以及下次校准和/或检测的日期； （d）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节； （e）损坏、故障、改装或修理的历史。 人员档案 实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等技术档案。 缺陷三、记录 内容 形式 保存 缺陷四、质量控制 SOP文件的现行有效性 仪器的标志及维护保养 试剂及耗品的质检 PCR检测流程 标本采集 核酸提取 基因扩增 产物检测 DNA、RNA的浓度和纯度测定及保存 此法准确、快速，且不损坏样品。可测出浓度低于2.5ug/ml的核酸。测定时将样品作适度的稀释。用紫外分光光度仪检测，记录280nm和260nm处的吸光度。280nm为蛋白吸收峰，260nm为核酸吸收峰。其中260nm处读数用来计算样品的核酸浓度。 1 0D/A260nm=50ug/ml双链DNA 1 0D/A260nm=33ug/ml单链DNA 1 0D/A260nm=40ug/ml RNA DNA总产量（ug）= OD (A260nm)×50ug×稀释倍数×样品总体积 DNA浓度（ug/ml）= OD值(A260nm)×50×稀释倍数 提取RNA总产量（ug）= OD值(A260nm)×40ug×稀释倍数×样品总体积 RNA浓度（ug/ml）= OD值(A260nm)×40×稀释倍数 2、琼脂糖凝胶微型电泳法 未知浓度的微量DNA片段可与已知浓度的DNA同时电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度其含量。电泳时各DNA的体积要准，否则会有误差。 3、纯度检查 天然DNA的吸光度比值为A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515 纯DNA液的A260:A280:应为1.8-1.9。如比值低于1.6时，这提示有蛋白质和酚的污染，应进一步纯化。 4、RNA完整性检查 常用变性的琼脂糖电泳法检查，常用的变性剂为甲醛、乙二醛和羟甲基汞。完整的RNA经变性电泳后能分离出核糖体RNA中的28S和18S，且EB的显色强度应为2:1左右。如28S带降低而18S带增加则表示RNA标本有所降解。 5、DNA、RNA的保存 4℃是DNA保存的最佳和最简单的条件之一。-70℃可能是长期保存的良好温度。但解冻时DNA可产生缺口，因此不宜反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0），4℃储存6个月以上，其中EDTA还可抑制微生物生长。 RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin）， 终浓度为2U/10μl，置-20℃保存备用。 血清标志物用于疾病诊断、流行病调查 基因检测用于 疗效监控、预后判断 英国HBV血清学诊断的SOP(V.SOP6) 实验室检测抗-H