乙肝病毒的检测［PPT课件］.ppt

乙肝病毒的检测;HBV 的三种形态;乙型肝炎病毒HBV;２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为不完整的ＨＢＶ． ３.管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起的，也含有表面抗原．;*;*;乙型肝炎的两对半 1.乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和表面抗体(HBsAb)， 2.e抗原(HBeAg)和e抗体(HBeAb)，3.核心抗原(HBcAg)和核心抗体(HBcAb)这三对 乙肝病毒的抗原和抗体。 由于HBcAg主要存在于受感染的肝细胞及乙肝病毒颗粒的核心内，一般血清中较难检测到，只有用特殊的方法处理后才能查到，所以通常只能检测到HBcAb，也就是说这第三对通常只能检测到半对，所以称之为两对半。两对半是乙肝病毒最常用的血清学标记。 ;乙肝五项的32种组合;;;*;*;病毒基因突变;分型方法;客观看待乙肝DNA;乙肝病毒DNA 定量不能说明病情轻重乙肝病毒DNA 定量数值只能说明游离在血液中病毒的含量，病毒多少、含量高低与病情严重程度没有直接关系。乙肝病情严重程度必须通过检测肝功系列指标确定，这些指标包括：转氨酶、胆碱酯酶、胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度、转肽酶、蛋白电泳等等，凝血酶原活动度、白蛋白、胆碱酯酶数值越低，说明病情越严重。病毒定量数值高低与病情无直接关系。相反，绝大多数无症状乙肝病毒携带者，尤其是少年儿童患者，乙肝病毒DNA 检测都为阳性，乙肝病毒处于高复制状态，而他们的病情十分轻微，肝穿结果显示，他们的肝组织仅为轻度的非特异性炎症改变；而大多数肝硬化或肝癌患者的乙肝病毒DNA 检测多为阴性，而病情却十分严重。乙肝病毒本身不引起肝细胞病变，感染的肝细胞仍然是长寿的，半衰期6 ～12个月或更长。乙肝病情轻重决于很多因素，例如患者的免疫状态、遗传因素、病毒的变异等，病毒数量多少不是病情演变的决定因素。 ;4.HBV 临床药物治疗监测;乙肝五项检测的影响因素;2、试剂的影响2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%—99.3%,78~89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液???稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。;3、操作技术的影响3.1加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。3.2温浴影响，96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。3.3冼涤是ELISA操作的重要环节，手冼条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。3.4肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。;4、HooK效应影响 钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。 随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。;5、干扰物质的影响有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig 抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56℃30分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体