付强-金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.5［PPT课件］.ppt

金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立 答 辩 人 付 强 专 业 生物化学与分子生物学 指导老师 崔亚丽 教授 答辩日期 2007-5-31 西北大学硕士研究生论文答辩 1 答辩内容 • 背景介绍 • 研究报告 金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立 • 全文总结 • 致谢 西北大学硕士研究生论文答辩 2 西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍 乙型肝炎病毒概述 • 乙肝病毒（HBV）是一种嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原体。 电镜下HBV 颗粒的三种形态 （摘自N Engl J Med 2004, 350: 1118-29） HBV结构模拟图 3 西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍 乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 4 HBsAg 种类 大蛋白（L HBs） 中蛋白（M HBs） 主蛋白（S HBs） 西北大学硕士研究生论文答辩 背景介绍 5 HBsAg的主要作用 介导病毒进入宿主细胞 诱导机体产生保护性抗体 （HBsAb） 早期诊断的血清学标志 西北大学硕士研究生论文答辩 化学发光免疫技术 背景介绍 概念： 集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。 特点： 特异性高，敏感性高，操作简便、快速，试剂无毒，安全稳定，可自动化。 目前，已有许多将化学发光免疫技术应用于临床检测的研究报道。如应用化学发光免疫分析法定量检测乙肝病毒标志物1，磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素2等；相关的检测仪器，如：ACCESS 化学发光免疫分析仪(美国Beckman Coulter 公司) 8 1. 化学发光免疫分析定量检测乙肝病毒标志物方法学研究，标记免疫分析与临床，2004, (11)3: 157~159. 2. 磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素的应用，国外医学临床生物化学与检验学分册，2005, (26)4: 193~198. 西北大学硕士研究生论文答辩 以金磁微粒为载体的HBsAg免疫学检测方法原理图 背景介绍 9 西北大学硕士研究生论文答辩 研究目的及意义 • 研究目的 以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫学检测方法，并用标准HBsAg血清盘对该方法进行验证和比较，以期开发新的检测系统用于HBsAg 的检测。 背景介绍 • 研究意义 HBsAg的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。 10 实验I 西北大学硕士研究生论文答辩 Ⅰ. 以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原 HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择 温育时间的选择 显色时间的选择 精密度考察 灵敏度考察 特异性考察 11 实验I 西北大学硕士研究生论文答辩 HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被 包被前抗体溶液在280 nm处具有明显的光吸收，包被反应完毕后剩余溶液在280 nm处几乎没有光吸收出现，说明抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体几乎全部包被在金磁微粒表面。 HBsAb包被前后的紫外吸收曲线 12 实验I 西北大学硕士研究生论文答辩 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定 不同量的包被抗原和不同稀释度的HRP-标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果 注：P：阳性血清；N：阴性血清 酶标 抗体稀释度 50 100 200 300 400 1:600 P N 1.331 0.056 2.321 0.058 2.573 0.069 2.582 0.051 2.769 0.053 1:800 P N 1.14 0.05 2.168 0.058 2.308 0.054 2.533 0.052 2.362 0.053 1:1000 P N 0.848 0.05 1.839 0.05 2.074 0.05 2.175 0.05 2.208 0.05 1:2000 P N 0.561 0.05 1.113 0.05 1.330 0.05 1.472 0.05 1.506 0.51 1:3000 P N 0.294 0.05 0.371 0.05 0.537 0.05 0.478 0.05 0.483 0.05 抗体包被量 （ng/孔） 当控制阳性对照OD值在2.0以上，阴性对照OD值在0.05以下（小于0.05，以0.05计）时，有三个方案可满足此条件，为了减少实验成本，我们选择抗原包被量为2