地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法(期刊)..pdfVIP

维普资讯 醚 匿登 堂堂塑 2008Jan JF ,v。142N。 ujianMedUniv … 49 地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法 姚丽君 ，卫积书 ，魏雪英 ，陈 豪 摘要 ： 目的 制备卫 氏并殖吸虫线粒体细胞色素 C氧化酶亚单位 I(COI)基 因和核糖体 DNA第二间隔区 (ITS2)地高辛标记探针 ，探讨其对并殖吸虫的种别鉴定和诊断的作用 。 方法 利用引物分别体外扩增获得卫 氏 并殖吸虫 目的基 因后凝胶 电泳鉴定并且胶 回收纯化上述两个基 因片段 。将酶切后 的COI基 因和 ITS2基 因回收， 地高辛标记成探针 ，尼龙膜上行斑点杂交观察 。 结果 COI探针有较好的特异性和敏感性 。ITS2探针缺乏特 异性 。 结论 尼龙膜斑点杂交结果显示卫 氏并殖吸虫的COI基因片段可 以作为种群鉴定的后备探针 。 关键词 ： 卫 氏并殖吸虫；地高辛；DNA探针 ；DNA，核糖体 ；序列分析 ，DNA；克隆．分子 ；核酸杂交；基因 中图分类号 ： R383．23；R394．2 文献标识码 ： A 文章编号： l672—4194(2008)01—0049—03 并殖吸虫在全世界广泛分布，在亚洲、非洲 、拉 1．1．2 主要试剂和仪器 PCR反应试剂盒 (美 国 丁美洲 30余国家及我国23个省市和 自治区不同程 Promega公司)；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒 (上 度流行[1]。目前世界上报道的虫种将近 50种 ，其 中 海中科开瑞公司)；尼龙膜 (英国Amersham公司)； 在我国报道和发现 的并殖 吸虫 28种 。对于并殖 吸 地高辛标记试剂盒 (上海 Roche公司)。PCR扩增 虫分类标准的认识不一 ，加之不 同地 区、不 同宿主 仪 (PCRSystem2400，美 国PE公司)；半 自动凝胶 体内收集的虫体存在变异 ，标本处理和观察方法不 图像分析仪 (GDS-8000，美 国 Uhro—Violet公司)； 同以及观察者的主观性等原 因，造成虫种 的鉴定和 紫外 分光光度计 (Ultrospec2100pro，英 国 Bio— 分类的复杂性 。由于并殖吸虫致病类型多样，以及 chrom有 限公 司)；低温冷冻离 心机 (2K15，德 国 免疫学诊断与其他寄生虫之 间存在较多交叉反应 Sigma公司)。 现象，目前 尚无 很 好 的诊 断 方 法 ，误 诊 率 达 1．2 方法 29．3 ～ 57．6 [2] 。 本研究利用引物分别体外扩增 1．2．1 引物设计与合成 引物 由上海博亚生物公 获得卫氏并殖吸虫 CO I基因和 ITS2基 因，用地高 司合成。引物的序列如下： 辛标记成 DNA探针 ，利用探针和尼龙膜上 已知的 COI基 因 基因组反应来观测所获得 的探针是否可以成为一 上游引物 ：5’GATTTTGCCTGGGTTTGGTA 3’ 种临床诊断和分类的后备探针 ，以进一步完善 目前 下游引物 ：5’ACGACGAACCACGTATCAT 3’ 的诊断和分类方法。 ITS2基 因 上游引物 ：5’ATATTGCGGCCACGGGTTA3’ 1 材料与方法 下游引物 ：5’TCACGTCTGATCCGAGGTC3’ 1．1 材料 1．2．2 PCR扩增 模板 DNA2．5 L，上游引物 1．1．1 卫氏并殖吸虫成虫 从福建省 闽清 、建瓯、 (10 mol／L)1．0 L，下游 弓l物 (10 mo