ING4真核表达载体的构建及对胶质瘤细胞U87MG增殖的影响.ppt

研究背景 INGs（INhibitor of Growth肿瘤生长抑制因子）是近些年发现一个肿瘤抑制基因家族，包括ING1、ING2/ING12L、ING3、ING4 、ING5和三种酿酒酵母INGs（Yng1、Yng2、及Pho23）, 它们彼此之间保持较高的同源性。ING4基因是新近发现的ING基因家族的新成员，定位于人12q13-32，由8个外显子和7个内含子组成，编码248个氨基酸分子。其功能可能与负性调节细胞生长和接触抑制及血管生成有关。 国外研究发现，多种肿瘤中可发现存在ING4基因的异常或ING4蛋白表达的降低，如乳腺癌、直肠癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性胶质瘤及头颈部鳞状细胞癌等。 研究证实ING4 基因编码蛋白的表达水平随着脑胶质瘤恶性程度的增高而降低。ING4 基因在正常脑胶质细胞中比低度恶性脑胶质瘤中的表达水平高2～3倍，比高度恶性脑胶质瘤中的表达水平高6倍。我们有理由推测ING4基因的异常及蛋白表达降低与胶质瘤发生发展有关。 已研究证实，该因子对神经胶质瘤的基因治疗具有潜在的重要价值。为了进一步研究该因子对胶质瘤的治疗价值，我们首先构建真核表达载体pcDNA3.1-ING4,并利用脂质体Lipofectamine2000将其转入U87MG细胞，通过检测ING4基因的表达的改变及胶质瘤细胞U87MG细胞增殖所发生的改变，推测证实ING4对U87MG细胞增殖的影响，并进一步探讨ING4抑制肿瘤细胞增殖的机制是否与p53及cyclinB1有关。 材料与方法 ING4基因的克隆、序列测定和真核表达载体的构建 。 引物设计 →扩增目的基因片段→目的基因ING4克隆及真核载体pcDNA3.1-ING4的构建→重组质粒的抽提纯化、测序和鉴定 。 2. U87MG细胞培养、ING4基因转染、筛选和表达。 U87MG细胞采用DMEM10%进口小牛血清培养→用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-ING4质粒和空载pcDNA3.1质粒分别转染U87MG细胞→在G418压力下筛选，建立稳定表达ING4细胞模型→ 提取转染ING4克隆细胞基因及总蛋白，挑选高表达ING4蛋白的U87MG细胞。 3. ING4对U87MG细胞增殖影响的多方面研究。 ①细胞计数及生长曲线绘制 ②细胞集落形成计数 ③MTT法检测细胞生长情况 ④观察ING4对胶质瘤细胞U87MG放射治疗的是否有增 敏作用 ※以上实验均以转染空载质粒的细胞作为对照。 实验④ 给予6000GY γ射线下连续照射。 4. ING4抑制U87MG细胞增殖的机制的研究。 设计P53及cyclinB1 的引物，采用PCR进行基因扩增；应用Western-blot方法 提取细胞中的总蛋白，检测分别转染目的基因ING4质粒及空载质粒U87MG细胞中ING4、P53及cyclinB1基因蛋白表达情况，均以GAPDH为内参照。 结 果 1.经测序成功扩增出未发生基因突变 的正确的ING4功能片段，大小为750bp。 2. ING4在转染目的基因质粒U87MG细胞中的表达增高。 3.绘制生长曲线、集落形成试验、MTT检测显示转染ING4的瘤细胞生长受抑。见图1.2.3 4. ING4增强U87MG细胞对放射治疗的敏感性.见图4 . 5.转染ING4的U87MG细胞P53（图1）及cyclinB1（图2.3） 的表达降低。 讨 论 Gong等在2004年发现ING4是一种信号分子，可以调节细胞的存活、生长。ING4的表达在人神经胶质瘤组织中与正常脑组织比较是降低的，其表达水平由低级别肿瘤到高级别肿瘤是逐渐下调的，提示ING4表达下降可能与胶质肿瘤的发生有一定关系 。 我们构建ING4真核表达载体，转染低表达ING4的U87MG细胞，并通过与转染空载质粒的瘤细胞进行对照，发现无论是在基因水平还是蛋白水平转染ING4质粒的U87MG细胞能够稳定高表达ING4蛋白。同时我们进行了几种反映肿瘤细胞生长增殖速度的实验，实验结果表明转染ING4的瘤细胞生长受到了明显的抑制，同时发现转染ING4瘤细胞在射线照射下致死率明显高于空载细胞，说明ING4能够抑制胶质瘤细胞的生长，可以提高瘤细胞对射线的敏感性。 ING4是一种核蛋白，其C端具有核定位信号与p53复合定位于细胞