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从母亲血浆中进行非创伤性胎儿血型检测 胎儿/新生儿溶血疾病 贫血症 高胆红素血症 水肿胎型 肝脾肿大 原因: 溶血性贫血源于母体的IgG 同种异源抗体 新生儿溶血病: 诊断及后续 妊娠期间的抗体浓度测定 超声 大脑中动脉的多普勒超声检查 Rh-预防 针对RhD的免疫接种可以避免如果 接种前 适当剂量的 anti-D 免疫球蛋白 被给予 Anti-D 同种异体免疫的频率 为何要开展胎儿 D状态的非创伤性测定？ Anti-D 免疫球蛋白: 不完全统计， 38.5% 的 D-妊娠均为白人 (17.3% 在德国) 人源物质 潜在侵染性 供给简单 费用 一些 RhD 细节 D阳性 少量D-抗原密度 (D-等位基因: 弱 D, 部分的D) D阴性 RH 单倍体重排 胎儿 RHD 基因分型里程碑 母体血浆中的细胞游离态胎儿 (cff) DNA 它从哪儿来？ 胎儿细胞编程性死亡? 胎盘! 没有固定的屏障 滋养层 (Guibert et al.,Hum.Repr., 2003;18 (8), 1733-36) 母体血浆中胎儿DNA的快速清除 样本运输:白细胞降解 样本运输:目标稳定 样本的制备和储存 特异性无风险胎儿和新生儿评估系统(SAFE) 目的 为了完成常规的，有效的无风险性产前诊断（NIPD）以及新生儿筛查，在欧共体内外建立长期的合作。 挑战: 侵入性检测 vs. NIPD 游离胎儿DNA浓缩（cff DNA）Galbiati et al. Hum Genet (2005) 117:243-248 妊娠期的3个月: 23,1 (0-265) geq/ml (n=221) 妊娠期的3个月: 32,4 (0-346) geq/ml (n=677) 妊娠期的3个月: 77,7 (0-391) geq/ml (n=121) 游离态胎儿DNA的浓缩物波动 Zhong XY et al. Obstet Gynecol 2000;96:991-6 未妊娠妇女的总DNA:1,9 – 67,9 (n=13, 3-6 不同天数, 平均 13,5) 妊娠妇女总ＤＮＡ: 1,3 - 130,5(n=16, 3 不同天数, 平均: 21,5) 母体血浆中cff DNA : 1,4 - 4,5 (n=10, 3 不同天数, 平均: 2,2) IVDD 98/79/EC 附件I: 基本要求 (3) 产品生产者对于性能的阐述 分析敏感性 (更低的测量下限) 诊断敏感性 分析特异性 诊断特异性 精确度 重复度, 内部/中间检测的差异度 重复性, 包括已知相关干扰的对照以及检测范围 IVDD 98/79/EC 附件I: 基本要求 (3) 校准或作为对照物质的评估必须通过可行性 参考测量规程 并且/或者采用 更高等级的参考物质 批量检测的标准必须确定 3.2. 核酸扩增技术(NAT)的其他要求 3.2.1. 目标序列的扩增检测中, 每个检测样本（内在对照）的功能性对照反映了该流程的状态。并且该对照应该应用于整个流程当中，如：抽提，扩增/杂交，检测。 SAFE: RHD NIPD 标准化 工作流 ＤＮＡ提取方法: 原理 固相 膜 颗粒 方法 RHD NIPD 技术平台评估(大规模) 自动化 DNA-提取方法 SAFE-NoE 调查 2006 德国可行性研究：母体血浆进行的胎儿RhD基因分型 该项研究的４个目的 确定一个用母体血浆检测胎儿Ｄ状态的手工和ＤＮＡ自动提取流程的灵敏度，特异性，准确度和可行性。 确定新生儿血清学Ｄ测定的灵敏度和特异性 确定在Ｄ－孕妇中ＲＨＤ＋的妇女比例 确定ＲＨＤ＋新生儿与ＲＨＤ－新生儿的比例 研究计划 至少１０００例妊娠过程中采用母体血清检测胎儿ＲＨＤ状态的非创伤性检测。 与新生儿的Ｄ状态比对，参考血清学 血清学的资料存于母体文档 “Mutterpass” 。其中还包括新生儿的Ｄ状态和Ｒｈ预防的相关材料 如果观察到不一致，最后的结论将取决于第二次部分检测以及新生儿的颊粘膜拭子检测 临床研究清单 伦理方面 样本收集 全德国的１７３个妇科医生网络 每个孕妇抽取15 ml EDTA 外周血 获得所有参与者的同意 方法 Chemagen 磁性分离 组件 1  (Chemagen, Baesweiler, Germany) 采用磁性颗粒对ｃｆｆ抽提的首次评估 Real-time PCR RHD exons 5 (Dψ neg.) and 7 (one exon had to be positive) 2 Replicates/sample: 2/2 positive/negative ? D-positive/negative 1/2 re