第四章酶的来源与筛选PPT.ppt

第三章 酶的筛选 一、酶的来源与多样性 可以通过两条途径 1．化学合成，包括酶的化学全合成、模拟酶的 化学合成。 2．生物合成，从生物中提制。 少数来自于动植物，多数（80%以上）来源于微生物； 微生物作为酶源的优点： (1)种类繁多，易筛选：凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找到．并可根据应用特点和要求，筛选出最佳的产酶菌株； (2)繁殖快，发酵周期短，培养简便，能通过控制培养条件大幅度提高酶的产量； (3)微生物具有较强的适应能力，可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想菌株。 生物 已知种类 估计总的种类 所占百分率 细菌 4760 800000～ 3000000 0.2%-0.6% 古细菌 ＜500 50000～ 500000 0.1%-1% 真菌 69000 1500000 5% 病毒 5000 130000 ? 4% 微生物多样性赋予的酶开发的巨大开发潜力 1)不可培养微生物：指在实验室内,采用常规培养方法培养不出的微生物。（占全部微生物的99%） 绕开菌种分离、纯化的步骤，应用分子生物学方法，直接从中寻找有开发价值的、新的微生物酶基因和新的酶种。 二、酶的寻找和发现 1.?反应过程的设计 选择合适的合成的反应途径、反应底物或原料 底物：价廉、易合成 酶：是否易得、活性、稳定性。 资料查阅：是否有已确定的能转化该反应的或相似反应的酶。 氨基酸生物合成的多条途径 brenda (http://www.brenda.uni-koeln.de/) 大量关于酶的信息：包括酶的分类，序列、结构、功能、特性（稳定性、最佳pH、最佳反应温度）、底物\产物、催化的反应，代谢途径，抑制剂、激活剂，辅助因子等 Ligand 数据库http://www.genome.ad.jp/ligand/ 包含了化合物（除常规代谢途径的化合物外还包括其他化合物、如：药物、多糖）、酶、反应。 Biocatalysis/biodegradation 代谢途径和生物转化，主要包含代谢途径、反应、化合物、酶。 2. 酶的寻找 获得新酶的方法 ⑴筛选新酶：从自然环境中； ⑵发现现有酶的新活力（非自然）； ⑶利用新的反应条件，如改变反介质，或新的影响因素（如金属离子）； ⑷酶的改造，主要指利用基因工程技术，突变酶,定向进化； ⑸人工酶。 脂肪酶的催化混杂性 脂肪酶的催化混杂性 3.酶或产酶微生物的筛选 （1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选 从自然界筛选产酶微生物一般步骤： 1.采样：生物多样性环境；高选择压力环境（针对与工艺条件相似的环境）。 2.富集培养：取其所好，投其所抗。 3. 分离：稀释涂布、划线分离。 4.筛选 初筛：最普通的筛子——快速简单，筛去大部分非目标株，尽量保留有潜力的候选株。 1）琼脂板涂布法 筛子： 以底物或底物类似物为唯一的碳、氮原 ； 底物的转化或产物的形成在琼脂培养皿上产生的半透明圈。 产物的衍生化或络合：衍生化或络合试剂与产物的某些功能团形成呈色圈。 色原性底物：通过酶催化时颜色的变化,对菌群进行可视的直接鉴定。 指示菌株：对产物能显示某种生理变化，如生长、或不生长。 水解酶活性检测中最常用的色原性底物-对硝基苯基衍生物 脂肪酶—对硝基苯酯 蛋白酶—对硝基苯酰胺 糖苷酶—对硝基苯糖苷 对硝基苯糖苷 水解释放黄色对硝基苯酚或苯胺 其他常用的发光底物 试卤灵（resorufin）,1-萘酚衍生物。 荧光底物-伞形酮（umbelliferone）作为内置荧光团的衍生物 缺点：只能模拟目标真实底物。 氧化还原酶活性检测 基于NAD(P)H生成的比色法 NAD(P)H在340nm的吸光度可用于检测信号。 间接法：四唑氮蓝（NBT）/吩嗪硫酸甲酯（PMS）法，在PMS存在下，NAD(P)H与黄色的 NBT反应，可生成蓝紫色甲臜（formazan），吸收波长：580nm。 过氧化物酶 ABTS(2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)检测法 ABTS可被过氧化物酶氧化呈浓绿色 邻联茴香胺-氧化呈红色。 2） 微孔板悬浮法 需有吸光度的变化，可见，或荧光。 3）微珠细胞固定化法 Freeman等人设计的微珠固定化方法,通过物理手段使单个细胞附着在单个聚丙烯酰胺固体。 .4）流式细胞计数法 细胞通过高速流动系统, 排成单行,逐个流经检测区进行。