医学课件流式细胞仪分析技术及应用.ppt

第十七章 流式细胞仪分析技术及应用 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） 主要由计算机及其软件组成 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 荧光染料的特性 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。 第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制 外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月） 适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。 第四节 在免疫学检验中的应用 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 二、淋巴细胞功能分析 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 四、肿瘤耐药基因分析 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 （一）单参数直方图 单参数直方图 细胞相对数量 信道(channel ) 1.双参数直方图点图 绿色荧光强度 红色荧光强度 双参数直方图点图 （四）流式细胞仪的多参数分析 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 三、设门分析技术 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为任意门 线性门 D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+ 如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。 单细胞悬液 一、