核酸分子杂交技术101108PPT课件.ppt

* 严永敏 细胞与分子诊断系 yym@ujs.edu.cn 目 录 基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术 分子杂交 当两条不同来源的单链核酸分子DNA-RNA或DNA-DNA链之间存在互补的碱基序列时，通过碱基互补配对形成双链杂交体的过程，称为分子杂交（molecular hybridization） 。 分子杂交图 概念：用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核 苷酸序列互补杂交的核酸片段（DNA/RNA ）。 用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。 (DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA) 第二节 核酸探针 2．随机引物法 (random priming) 人工合成6~8bp不同排列顺序核苷酸片段引物，在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入一种被标记dNTP时，即可形成标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。 优点：比活度高，结果稳定 随机引物标记法示意图 3．DNA探针的末端标记  Klenow大片段的末端标记法 DNA半抗原标记探针的检测 显色系统： 碱性磷酸酶—————— NBT-------紫色 辣根过氧化物酶———— DAB-------红色 底物 4. 探针的检测 第三节 核酸分子杂交技术 杂交类型 检测目的及范围 Southern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子 Northern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子 菌落杂交 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的DNA分子 斑点杂交 检测固定在膜上的DNA或RNA分子 原位杂交 检测细胞或组织中的DNA或RNA分子 ---DNA检测 将混合DNA样品经凝胶电泳分离，被分离的DNA片段从凝胶转移到膜上，经标记的探针杂交，从而检测特定DNA片段。 一、Southern印迹杂交 Paper Towels tissue SDS ProtK Phenol Chloro ETOH Spin Northern印迹杂交流程图 二、Northern印迹杂交 β-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达 三、基因表达产物的检测Western印迹法 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。 优点: 分辨率高(1~5ng);特异;简便;稳定 原位杂交 原位杂交(in situ hybridization, ISH): 利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通 过射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染 色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术。 基本步骤: What is FISH? Fluorescence In Situ Hybridization (荧光原位杂交) 一、FISH:一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术 **荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色；5）可以检测复杂的染色体异常：转位、缺失、微小缺失。 **FISH有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 基本原理 二、FISH检测标本 细胞-----中期染色体、间期核 三、用于FISH的探针种类 单一序列探针 重复序列探针 全染色体涂抹探针 着丝粒 端粒 用于FISH的探针1）单一序列探针：基因座特异探针 来源：Cosmid，Plasmid， cDNA片段 应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。 * * *