第6章 分子生物学研究法（下）.ppt

基因敲除技术 完全基因敲除 条件型基因敲除 1、完全基因敲除 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 基本原理: 构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择的标志 疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择 体外培养 新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选 将重组体导入ES细胞 存活的ES细胞 方法 表型分析 构建载体 同源重组 筛选X被敲除的ES细胞 显微注射 回交得到X被敲除的动物 2、条件型基因敲除 条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。 常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统 构建打靶载体 同源重组 筛选中靶ES 显微注射 杂交删除neor基因 特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段 动物观察分析 Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序： 体外培养 基因敲除技术的应用 1、研究基因调控和基因功能； 2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料； 3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学； 4、治疗遗传病，即基因治疗。 5、改造生物、培育新的生物品种。 6.3.1 酵母单杂交法 酵母单杂交（yeast one－hybrid system)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 6.3 蛋白质及其RNA相互作用技术 基因功能研究技术 分子生物学研究方法（下） 基因功能研究技术 6·1 基因表达研究技术 基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。 6·1 .1 基因表达系列分析技术 原理：根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。 SAGE程序: 分离提取mRNA 逆转录合成cDNA 4bp碱基的锚定酶（AE） 以与生物素相连的寡聚dT为引物 分离与抗生物素及微磁球相连的3 ′端cDNA 提取总RNA 3 ′端cDNA分两份 分别与连接子1和连接子2连接 标签酶（TE）切割 DNA聚合酶(Klenow)补平 含有9－14个碱基的标签 标签1 标签2 6·1·2 RNA选择性剪切 RNA选择性剪接是指用不同的剪切方式（选择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。选择剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。 类型 平衡剪切 5′选择性剪切 3 ′选择性剪切 相互排斥剪切 外显子遗漏 5′ss 3′ss 5′ss 5′ss 5′ss 5′ss 3′ss 3′ss 3′ss 3′ss 5′ss 3′ss 检测方法 RT-PCR cDNA 以两端特异序列设计引物 观察PCR产物大小是否存在差异 存在差异 有选择性剪切 提取不同组织的总RNA 分离mRNA PCR 不存在差异 无选择性剪切 6·1·3 原位杂交技术 原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）是用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 分RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。 FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。 荧光原位杂交技术 FISH （fluorescence in situ hybridization） 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 荧光原位杂交显示的着丝粒卫星DNA 荧光原位杂交显示的端粒 荧光素标记探针DNA 染