第一章蛋白质的分离与纯化课件PPT课件.ppt

第一章 蛋白质的分离与纯化; 蛋白质分离纯化的一般原则（掌握） 分配层析的基本理论（重点掌握） 蛋白质的层析分离技术 离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等 主要掌握操作要点及操作过程的注意事项 蛋白质的电泳分离技术 不连续系统原理（重点掌握） SDS技术（重点掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）;第一节 蛋白质分离纯化的一般原则; 根据实验目的选择合适的材料，应遵循： ; 注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异; 细胞的破碎; 物理法; 反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质; 化学法; 特异、快速、精确、可重复、经济; 利用溶解度的差异分离;盐析;硫酸铵沉淀; 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而减少氨基酸侧链基团的解离，降低蛋白质分子表面电荷，使蛋白质分子聚集导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出 ; 温度：在一定温度范围内(0～40℃之间)，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加;等电点沉淀; 根据分子量的不同分离; 根据电荷的不同分离; 亲和层析; 目的：避免目的蛋白的变性，保证其生物活性;第二节 层析的基本理论; 假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一 定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂 A物质在两相中相互扩散 A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两 相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数 ;二、分配层析的机理;（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然 （4）在该溶剂系统中，A和B两物质的分配系数分别设为：; 如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为1。根据分配定律，M加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：;A和B物质在层??柱中 1. 分配10次；2. 分配20次；3.分配30次;二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为： 层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散 层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行 ; Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么， 在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。 ;塔板理论的要点： 分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得;第三节 蛋白质的层析分离;一、离子交换层析 (ion exchange chromatography);; 原理： 利用分子筛效应分离提纯具有生物活性的生物大分子物质;; 样品的准备 凝胶的选择与处理 装柱（L:W=50-100:1） 柱填充的检测 上样（1%-5%) 洗脱 目的蛋白的鉴定与回收 层析柱再生与储存;用途; 原理： 利用生物大分子与其特异性配基的专一性识别和可逆性结合而建立起来的分离方法 ;亲和层析;四、其它层析技术;第四节 蛋白质的电泳分析;一、定义(electrophoresis) ; 带电质点的净电荷与迁移率有关，带电性质决定其 运动方向;三、电泳的分类; 是带电的物质，都可采用某种电泳技术，分离成 不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析 样品用量少 设备简单 可在室温进行 操作简便，消耗时间不多 不同类型的电泳，有不同的用途 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大提高 分辨率 ; 任意物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动; 指带电质点或颗粒在单位电场强度下的泳动速度 ; 溶液的离子强度：影响电动