血清球蛋白的分离纯化（纯化部分）课件.ppt

用洗脱液加满柱子，加快流速，清洗层析柱。 清洗完毕后，保持胶面上方有4-5cm高度缓冲液，关闭止水螺丝。 7.清洗 * * * 生化教研室 血清γ-球蛋白的分离纯化 ——盐析、层析技术 1. 掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程 2. 熟悉盐析、离心、层析等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用 实验目的 硫酸铵盐析初步分离γ-球蛋白 盐析原理 中性盐能破坏蛋白质溶液的水化膜,中和蛋白质的表面电荷,从而使蛋白质聚集沉淀 分段盐析 由于不同蛋白质分子颗粒大小、亲水程度、所带电荷的不同，盐析所需的盐浓度也是不同的。 当调节不同的盐浓度，不同蛋白质将会分段沉淀，即分段盐析。 50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。 分离γ-球蛋白理论依据 实验试剂及器材 离心管、离心机，滴管等 血清，饱和硫酸铵溶液，PBS溶液等 血清 1ml (20d) 饱和硫酸铵0.5ml (10d) G 充分混匀 离心 5min 4000rpm γ- G 1. 33%硫酸铵盐析分离γ-球蛋白 2. γ-球蛋白溶液的制备 PBS 0.5ml (10d) （1）离心管要平衡对称； （2）离心机的启动、停止都要慢； （3）开始前，盖子盖紧； 结束后，减速、关电源、自然停止。 （4）过程中，若有异响，立即停止，检查离心管。 离心机的使用方法及注意事项： 二.凝胶层析纯化γ-球蛋白 凝胶层析的定义 又称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。 葡 聚 糖 凝 胶 颗 粒 凝胶层析的原理 物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。 被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。 实验器材及试剂 器材 层析柱，白瓷板，试管，滴管等 试剂 PBS缓冲液，双缩脲试剂、 Nessler试剂等 平衡 上样 洗脱 清洗 收集并检测 凝胶层析脱盐 凝胶处理 装柱 ①自然溶涨法 将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 1.凝胶处理 ②加热法 在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 2.装柱 （1）装柱前准备: 将层析柱下端的止水螺丝旋紧，往层析柱加入2-3ml洗脱液, 以确保凝胶底部没有气泡。 （2）装柱：把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。最好一次连续装完，待凝胶装至10-15cm即可。注意防止气泡与分层,可用玻棒搅拌使 表面平整。 3.平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，并始终保护凝胶上端有一段液体。 将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝，取前面制备好的γ-球蛋白样品小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内，当样品流至略高于柱床表面时，关闭止水螺丝。 4.上样 用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每5秒一滴的流速。 5.洗脱 收集洗脱液，每管收集12d，共收集12管，同时对收集液体进行检测。 6.收集与检测 蛋白质检测 在各收集管中各取出1滴收集液滴于比色板孔中(按编号顺序)，加入1滴双缩脲试剂，观察并记录实验现象。 从收集到的试管中取收集液1滴于比色板中，加入奈氏试剂1滴，观察并记录实验现象。 NH4+检测 实验结果 * * *