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第三章  细胞生物学研究方法 图示： 鼠主动脉平滑肌的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red ⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的抗原进行反应，在荧光显微镜下观察到明亮的特异荧光。 ⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。 ⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白质等大分子的定位 b.观察过氧化物酶体 特异蛋白质生物大分子定位 载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察 待定蛋白质在细胞内的位置分布 观察过氧化物酶体 GFP ＋过氧化物体内的酶（有定位信号） 导入不同细胞 荧光显微镜下观察各种细胞的过氧化物酶体 分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通光镜的3倍。 应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建 通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快 第四节 模式生物 思考题 第二节 细胞组分的分离及分析技术 一、细胞组分的分离——离心技术 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min。 （一）差速离心 Differential centrifugation 1、特点： ——介质密度均一； ——速度由低向高，逐级离心。 2、用途： 分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核→线粒体→溶酶体与过氧化物酶体→内质网与高基体→核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）pH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。 1、速度沉降velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离的目的。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 2.等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 特点： 1）介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。 2）所需的力场通常比速率沉降法大10～100倍，往往需要高速或超速离心。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 1. 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）显示方法 二、细胞组分的化学染色 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 3. 联苯胺反应：过氧化物酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质。 三、放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新