第二章 病毒培养.ppt

第二章 病毒的培养 第一节 实验动物 家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 1、分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 2、测定各毒株之间的抗原关系 3、制备免疫血清和单克隆抗体 4、作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定，建立病毒病动物模型 5、培养病毒，制造抗原和疫苗 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 一、优点1、组织分化程度低，病毒易于增殖2、可选择不同的日龄和接种途径3、感染病毒的组织和液体中含大量病毒4、容易采集和处理5、来源充足6、设备和操作简便易行 二、缺点1、胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒2、母源抗体3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针 三、受精卵的质量和孵化１、受精卵最好来自SPF鸡群２、受精卵应该是新鲜的３、受精卵的壳最好是白色的４、孵化温度37.5-38.5℃，湿度50-60%，通风。SPF(无特定病原微生物污染的) 四、接种途径1、绒毛尿囊膜接种 2、尿囊腔接种3、卵黄囊接种4、静脉接种 蓝舌病毒5、羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒6、脑内接种 狂犬病毒7、眼球接种 第三节 组织培养  组织块培养 器官培养 细胞培养 一、细胞原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。继代细胞：将已长成单层的原代细胞从瓶壁上消化下来再作培养获得的细胞。＝《100代 传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。无接触抑制现象，而原代细胞有BHK-21仓鼠肾细胞、PK-15、IBRS-2、MDBK牛肾、MDCK、Hela、Vero非洲绿猴肾细胞、TK-143、Marc-145、Sf9昆虫细胞瓶：800ml(100~150ml)100ml(10ml)50ml(6~8ml) 优点：1) 可以无限的传代。2) 不少细胞系对病毒很敏感。3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。 缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。 绿荧光蛋白在IBRS-2细胞中的表达 二、细胞培养所用器材1、玻璃器皿2、塑料制品3、橡皮制品4、滤器 蔡氏滤器、玻璃滤器、微孔滤膜 三、洗液和溶液1、Hanks液（NaCl、KCl、MgSO4、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4） 使用前用NaHCO3调pH值。2、Earle液（NaCl、KCl、MgCl2、NaH2PO4） 使用前用NaHCO3调pH值。 3、磷酸盐缓冲溶液（PBS）（ NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4 、MgCl2 、CaCl2） 4、组织培养常用抗生素液 5、pH调整液NaHCO3溶液（7.4%、5.6%、3.7%）Herpes溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸） 6、谷氨酰胺 7、 细胞分散剂（消化液） 能使组织块或成片细胞分散成单个细胞。１）胰蛋白酶溶液（trypsin solution） 作用机制：使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。其活力用解离酪蛋白的能力来表示，常见的有1:125和1:250两种。使用浓度：0.25%、0.125%、0.08%最佳作用条件：pH8.0、37℃ ２）乙二胺四乙酸二钠（EDTA）(Versene液）作用机制：与钙、镁离子结合使用浓度：0.02%使用方法：单独作用或与胰酶按一定比例混合作用３）灰色链丝菌酶 蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶 四、培养液（基）（一）天然培养基 动物血清、水解乳蛋白以及自制的体液或组织提取液 1、血清（serum）1）血清的种类和来源 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum) 2）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节