荧光分光光度计原理及应用.ppt

荧光分光光度计的原理及应用 一、分子荧光的产生 二、激发光谱与荧光光谱 2.荧光光谱 三、荧光强度和溶液浓度的关系 三、荧光强度和溶液浓度的关系 四、荧光、磷光分析方法的特点 第二节 荧光分光光度计的组成 仪器光路图 第三节 荧光分析法的应用 作业 P14 3 * * 1.电子激发态的多重度 单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。 第一节 荧光分光光度法原理 三重激发态T：电子自旋方向和处于基态轨道的电子平行。 2. 分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射。 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 磷光 内转移 外转移 系间跨越 延迟荧光 传递途径 辐射跃迁 荧光 振动弛预 无辐射跃迁 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l ?2 T2 内转换 振动弛豫 1.荧光的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大； 固定激发光波长, 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。 问题：荧光(磷光)的激发光波长如何选择？Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。 1 定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc （浓度高时如何？） 标准曲线法定量： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法定量： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。 2 定量方法 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 （4）可提供比较多的物理参数 缺点：应用范围小。 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 光源：氙灯?和高压汞灯，染料激光器 检测器：光电倍增管。 问题：参考光电管作用？ (1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 见表 * *