基因工程外源基因的表达.ppt

SD 序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的精确距离保证了 mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子 AUG 正好处于核糖体复合物结构中的 P 位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下，SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基， 均会导致翻译起始效率不同程度的降低。 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG 的50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 除此之外，从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA 的 5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位。 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。 生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的 U 和 A 出现的频率较高； 在 GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有 G 或 C 的简并密码子占 90% 以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多 细胞内 tRNA 的含量 基因突变 基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺乏而引起的基因结构的变化，从而引起表型的改变。 基因突变的特征 随机性：突变可发生在生物个体的任何时期和生物体的任何细胞 多向性：同一基因座上的基因可独立发生多次不同的突变而形成复等位基因 可逆性：突变的方向可逆,可以是正突变，也可以是回复突变 有害性：突变会导致许多疾病的发生 稀有性：在自然状态下发生突变的频率很低 可重复性：对于任何一个基因位点，基因可以一定频率反复发生 点突变 (point mutation) 点突变：DNA链中一个或一对碱基发生的改变。 两种形式：碱基置换和移码突变 碱基置换（base substitution）：DNA链中一种碱基对被另一种碱基对所替代，从而使三联体密码意义发生改变而引起的突变。 碱基置换分为：转换和颠换 A G T C 转 换（嘌呤和嘌呤之间、嘧啶和嘧啶之间替换） 颠 换（嘌呤和嘧啶之间的替换） 碱基置换可引起如下几种生物学效应： 1、同义突变 2、错义突变 3、无义突变 4、终止密码突变 同义突变（same sense mutation）：碱基被替换之后，产生了新的密码子，但新旧密码子同义，所编码的氨基酸种类不变，因此同义突变并不产生突变效应 。 错义突变（missense mutation）：碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。 错义突变引发疾病——镰刀状红细胞贫血 无义突变（non-sense mutation）：碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码UAA、UAG或UGA。 终止密码突变（terminator codon mutation）:DNA分子中的某一个终止密码突变为编码氨基酸的密码，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。 移码突变（frame-shift mutation）：基因组DNA链中插入或缺失1个或几个碱基对，从而使自插入或缺失的那一点以下的三联体密码的组合发生改变，进而使其编码的氨基酸种类和序列发生变化。 碱基对插入和（或）缺失的数目和方式不同，对其后的密码组合的改变的影响程度不同。 移码突变引起的最小变化是在DNA链上增加或减少一个遗传密码导致合成的多肽链多或少一个氨基酸，若大范围改变密码组合则会引起的整条多肽链的氨基酸种类及序列的变化。 移码突变的后果严重，通常是导致一条或几条多肽链丧失活性或根本不能合成，进而严重影响细胞或机体的正常生命活动。 外源基因在大肠杆菌中的表达 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 表现为不溶性的包涵体颗粒： 包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。存在部位：细胞质、细胞周质。 表现为可溶性的蛋白质： 可溶性的蛋白通常也叫融合蛋白，是将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改