抑制剂和增强剂.ppt

PCR抑制剂和增强剂 PCR抑制剂 SDS 苯酚 乙醇 异丙醇 乙酸钠 氯化钠 EDTA 血红素（heme） hemin（氯高铁血红素） tannic acids（丹宁酸） 抑制剂来源 抑制剂的作用浓度 例1：操作时温度不同产生的抑制剂 Shames等人（1995）使用PVP（polyvinylpyrollidone）在4℃分离粪便中的细菌DNA，然后用Chelex100处理。尽管用PVP在室温也可以分离DNA，但得到的DNA用于PCR扩增效果不够好，也许因为在更高的温度释放出了更多的PCR抑制剂。 例2：间接产生的抑制剂 Yoshii T等人1992年，用单根头发提取DNA扩增线粒体DNA一段333bp的非编码区。 所有实验均截取5cm长的毛干 后研究表明染色剂中的过氧化氢可以使不溶于水的黑色素变成水溶性的。 PCR增强剂 PCR增强剂可以增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多的PCR增强剂，原理各不相同，这些试剂不可能对所有的PCR反应都起作用。 根据其作用和原理，可以大致分为三类： 1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板（共溶剂） 2.用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性 3.用于优化引物和模板的结合 1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板的增强剂 甜菜碱（betaine），二甲基亚枫（DMSO）和甲酰胺（formamide），甘油，适合于扩增高GC含量和形成复杂二级结构的模板。 甜菜碱1M、DMSO1-10％（5%？）、甲酰胺1-5％、甘油1％-10％对某些反应可以显著提高产量，但过量的这些试剂会抑制PCR反应。 在高浓度时，许多添加剂和共溶剂都可以抑制PCR，对不同浓度的引物和模板DNA的组合都应该通过经验来确定其最适浓度。根据我们的观点，当PCR出现问题时首先考虑的不应该是使用这些增强剂，而应该是对反应体系的控制成分进行优化，尤其是镁离子和钾离子的浓度。这个普遍规律的一个例外是GC-Melt（Clontech公司）的应用，我们发现它常常能够克服和解决对富含G+C的模板进行扩增时效率低下的问题。 《分子克隆实验指南》 Frackman et al.(1998) have demonstrated (using NMR analysis) that the PCR additive provided by QIAGEN in their PCR core kit (Q-Solution) and that provided by CLONTECH in the Advantage-GC cDNA PCR kit is in fact Betaine which is available at a fraction of the cost as a 5M solution from Sigma-Aldrich (cat. # B 0300) 2.用于保护聚合酶的活性和稳定性的增强剂 有的反应中，0.1mg/ml的BSA、 0.1-10％的明胶（gelatin）或非离子型的去污剂，可以解决一些扩增失败的问题，这类试剂可以增加聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸附。 BSA可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用. 非离子去污剂，例如Tween?-20, NP-40和Triton? X-100等，可以抵抗痕量的强离子去污剂的抑制作用，比如0.01%的SDS。 3.用于优化引物和模板的结合 铵离子的添加，可以减少引物和模板的错配，提高反应的特异性，可以让PCR对反应条件的要求更低，所以很多PCR试剂都包含了10-20mM的硫酸铵。 氯化四甲胺tetramethyl ammonium chloride（15-100mM ）也起到类似的作用 4.其它增强剂 PEG 亚精胺 单链DNA结合蛋白 例：Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein 已知抑制剂： EDTA,SDS,Triton X-100，hemin（氯高铁血红素），bilirubin（胆红素），sodium glycocholate (甘胆酸钠)，sodium cholate plus deoxycholate（脱氧胆酸钠），sodium taurocholate,（牛黄胆酸钠），tannic acids（丹宁酸），humic acid(腐植酸)，氯化铁，氯化钠，采自泥炭和Suwannee河的腐植酸和fulvic acid(棕黄酸) PCR反应：扩增Bacteroides d