第十章高效液相色谱分析 课件.ppt

第十章 高效液相色谱分析 (high perfomance lquid chromatography) 第一节 概述 第二节 基本原理 第三节 固定相与流动相 第四节 高效液相色谱仪 第五节 定性、定量分析 第一节 高效液相色谱法概述 与经典液相色谱法比较 与气相色谱法比较 高效液相色谱的特点 第一节 高效液相色谱法概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200?m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！ 第一节 高效液相色谱法概述 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 ?m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。 第一节 高效液相色谱法概述 1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。 第一节 高效液相色谱法概述 2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 第一节 高效液相色谱法概述 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 第一节 高效液相色谱法概述 高效液相色谱的应用范围和局限性 应用范围 高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物，化工产品及环境污染物等等。 方法局限性： 使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器 分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解的生物活性样品 第二节 基本原理 一、柱内展宽 在色谱柱内各种因素引起的色谱峰扩展叫柱内扩展。 由气相色谱速率理论可知，范氏方程概括了影响柱效的各种动力学因素，将范氏方程加以修正后即可用于高效液相色谱。 第二节 基本原理 一、柱内展宽 1. 涡流扩散 第二节 基本原理 一、柱内展宽 2. 纵向扩散 第二节 基本原理 一、柱内展宽 3. 传质阻力 (1) 流动相中的传质阻力(Hm) (2) 滞留流动相中的传质阻力(Hsm) 第二节 基本原理 一、柱内展宽 (3) 固定相(液)内的传质阻力(Hs) 柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高度的关系归结为: 第二节 基本原理 一、柱内展宽 上式可简写为 第二节 基本原理 一、柱内展宽 第二节 基本原理 二、柱外展宽 柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起的色谱峰展宽。 第三节 固定相和流动相 一、固定相 1. 液-固色谱固定相 液-固吸附色谱所用的固定相，多是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子多孔微球以及分子筛。如果按结构和形态可分为： 第三节 固定相和流动相 一、固定相 薄壳型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而