分子细胞遗传学技术PPT课件.ppt

分子细胞遗传学技术与产前诊断;基因诊断的中心问题是认识 遗传变异、基因突变 及与表型之间的关系;一、分子细胞遗传学技术;荧光原位杂交技术（fluorescence in site hybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500 kb. ;荧光原位杂交技术（Fluorescence in site hybridization, FISH）的特异性DNA探针;染色体技术的 应用－1;细胞遗传学研究中染色体技术的应用—FISH技术检出 t(2; 14);染色体技术的 应用－2;;细胞遗传学研究中染色体技术的应用;比较基因组杂交（comparative genomic hybridization, CGH）;比较基因组杂交的原理; 待测DNA（肿瘤细胞DNA，test DNA)为绿色 参照DNA(正常细胞DNA，reference DNA）为红色 复染为蓝色;中期染色体的DAPI的 复染图;CGH的优点：;CGH的局限性：;二、突变分析与分子诊断;（一）基因突变类型;点突变的结果：;基因突变形式—碱基的插入和缺失;碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码产生截短型蛋白;基因突变形式;各种类型病理性突变的比例;（二）目前常用的对已知点突变的分析技术;1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析;2.等位基因特异性（PCR）扩增（ASA）;3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（?ASO）;4.基因芯片：SNP位点的检测;Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorphisms using dual-color fluorescence hybridization. Mutat Res. 2004; 548: 97-105;（三）目前常用的未知基因突变分析技术;体外蛋白截短实验（Protein truncation test, PTT） 定量多重PCR技术（Quantitative multiplex PCR, QM-PCR） 多重探针连接依赖性扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation, MLPA) DNA序列分析（DNA sequencing) ;1.异源双链体形成分析（HA）;2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）;3.单链构象多态性分析（SSCP）;4.体外蛋白截短试验（PTT）;上游引物5’端均连接T7启动子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG [35S]甲硫氨酸，T7 体外转录/翻译体系（兔网织红细胞提取物），30℃孵育90 min，完成体外蛋白质合成。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;5.变性高效液相色谱分析（DHPLC）;用离子对反相高效液相色谱检测DNA变异是基于同时存在同源双链和异源双链。异源双链的检出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度的选定与野生型DNA融解温度（Tm）有关。 DHPLC与其它突变分析技术的比较: 对单个核苷酸变异的检出率: SSCP技术, 约75%； DHPLC, 90%.;DHPLC的优点：;DHPLC分析：（野生型）;DHPLC分析: 突变型（单个碱基改变）;DHPLC分析: 突变型（单个碱基改变）;6.定量多重PCR技术（Quantitative multiplex PCR，Q-M-PCR）;定量多重PCR技术要点：;以检测外显子PCR产物与参照外显子PCR产物的比值计算模版DNA相对拷贝数，确定是否存在检测外显子的杂合性缺失； 检出的缺失经其它方法（长片段PCR或缺失断裂点测序）确认。 ;7. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcation — MLPA;三、遗传性疾病的诊断;遗传性疾病的诊断：;（一）临症诊断;Pedigree of a family;遗传性疾病基因诊断程序;DHPLC突变分析;体外蛋白截短试验（PTT） — HNPCC遗传性突变;DNA序列分析—碱基替换;DNA序列分析—移码突变;;APC 基因型和患者临床表型关系的研究;（二）症状出现前的诊断;对家庭其他人员进行症状出现前的基因分析;（三）产前诊断;