基因工程第四章载体PPT.ppt

M13 RF + - + - + - 外源DNA 转染E. coli 成熟的子代M13中 + + ① 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降 ② 实际克隆能力小于1500bp。 虽无包装限制，并非无限包装！ 5. M13载体的缺点 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。 MCS 噬菌体ori 质粒ori Ampr lacZ’ lacI 6. 噬菌粒载体（phagemid vectors） 约3000bp（比M13小） ②克隆能力大 能插入10kb的外源DNA。 ③两种复制形式 ①分子量小 （1）噬菌粒载体的特点 既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。 既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。 噬菌粒载体 质粒部分 单链噬菌体部分 辅助噬菌体 大肠杆菌寄主 pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 ?VX M13 M13变异株 XS127，XS101 pUC118/pUC119 pUC18/ pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL1-Blue 辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。 （2）常见的噬菌粒载体 ① 构成 1）M13的基因间隔区（IG） 2）pUC18/pUC19质粒载体： 带有M13复制起点。 质粒复制起点 Ampr lacZ’ MCS （3）pUC118/pUC119 两种不同的复制模式 1）双链质粒复制模式 受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。 每个细胞能达到500个拷贝。 ② pUC118/119的复制模式 来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。 2）单链滚环噬菌体复制模式 外壳蛋白 复制蛋白 辅助M13 包装 当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染后。 1）辅助噬菌体： 自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。 如M13K07等。 辅助噬菌体 外壳蛋白和 复制蛋白 噬菌粒载体 ssDNA 噬菌体 ③ 噬菌粒载体的包装 2）包装： Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。 由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。 ② 特点 ① 组成 MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。 1）定向体外转录 （4）pBluescript 噬菌粒载体（pBS） 2）两种复制模式 既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。 3）选择方便 有Ampr和lacZ’，可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。 4）插入方便 18个单一酶切位点的MCS SK：表示lacZ’的转录方向是沿MCS上的 SacI ? KpnI +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ’，能回收lacZ’的编码链（+） pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） KS：反向（ KpnI ? SacI ，MCS相反） -（f1-）：能回收lacZ’的非编码链（-） 1）pBluescript SK/KS（+/-）区分： ③ 常用的 pBluescript 载体 pCR系列载体 Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。 ① 结构 pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。 MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 ② 特点 PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。 （5）PCR产物克隆载体 T 载体 T vector的克隆过程——简便！ A A T T T vector PCR product T4 DNA ligase A A （1）噬菌体展示（Phage display） 将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。 G. P. Smith1985年发明。 丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的一端，有3-5个基因Ⅲ编码的蛋白质（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。 7. 噬菌体展示载体（ Phage display vector） 把外源DNA片断插入基因Ⅲ的序列前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。 启动子 外源DNA M13基因Ⅲ ori M13 display vector 外源多肽 （2）噬菌体展示载体的构建 （1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。 ?DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。 1. ?DN