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酸樱桃中原花青素分离与纯化 　　摘要：以ＮＫＡ树脂为吸附剂，对酸樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）中原花青素的分离纯化进行了研究。通过单因素试验分析确定了原花青素分离纯化的最佳工艺条件为，上样浓度７ ｍｇ／Ｌ，上样流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，用体积分数为９５％的乙醇溶液作为洗脱剂，以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速进行洗脱。经树脂纯化后的原花青素通过ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析确定其主要含两种组分，分别为原花青素－３－葡萄糖苷和（－）－表儿茶素没食子酸酯。 　　关键词：酸樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）；原花青素；ＮＫＡ树脂；分离；纯化 　　中图分类号：Ｑ９４９．７５１．８；ＴＱ９１４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）04－0800-04 　　酸樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）属蔷薇科李属（Ｐｒｕｎｕｓ Ｌ．）经济树木，其果实中含有丰富的原花青素［１－３］。原花青素（Ｐｒｏｃｙｎｉｄｉｎｓ，简称ＰＣ）是一大类多酚类化合物的总称，是由儿茶素、表儿茶素及表儿茶素没食子酸酯通过Ｃ４－Ｃ６或Ｃ４－Ｃ８连接而成的不同聚合度的混合物［４］。 　　原花青素具有较强的抗氧化作用，以及明显地抑菌、消炎、抗癌、抗老化和抑制胆固醇上升等功效，摄取一定量原花青素能够有效地预防和抑制疾病的发生［５－９］。目前，原花青素已广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等相关领域，并发挥着不可替代的作用，随着天然产物生产加工的逐渐兴起，原花青素更成为天然产物和有机化学的研究热点［１０－１３］。不过，对于酸樱桃果实中原花青素的开发利用，目前国内尚处于起步阶段，还未见相关报道，因此，从酸樱桃果实中提取原花青素并进行分离纯化的研究具有较大的开发潜力和实用价值。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　１．１．１原料与试剂酸樱桃：吉林市九站试验基地提供；ＮＫＡ树脂：南开大学化工厂生产；无水乙醇、甲醇、甲酸、石油醚、乙酸乙酯均为分析纯。 　　１．１．２主要仪器与设备循环水式多用真空泵（ＳＨＢ－Ｂ９５）：郑州长城科工贸有限公司；恒温水浴锅（Ｂ－２６０）：上海亚荣生化仪器厂；旋转蒸发器（ＲＥ５２ＣＳ－１）：上海亚荣生化仪器厂；真空冷冻干燥机（ＦＤ）：北京博医康仪器有限公司；高速冷冻离心机（ＳＣＲ２０ＢＣ）：日本日立公司；电子分析天平（ＡＢ２０４－Ｎ）：上海精密科学仪器有限公司；ＵＶ－２５０１ ＰＣ型分光光度计：日本岛津公司；Ｗａｔｅｒｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＺＭＤ４０００液质联用仪；Ｗａｔｅｒｓ ２６９０液相色谱仪（包括梯度泵、自动进样器等）；Ｗａｔｅｒｓ ９６６二极管阵列检测器。 　　１．２方法 　　１．２．１原花青素的测定方法采用盐酸－香草醛法［１４］。 　　１．２．２原花青素提取液的制备方法酸樱桃经清洗、去核后，用胶体磨处理１５ ｍｉｎ，按溶剂与物料质量比１∶４加入体积分数为７０％的乙醇，在６０ ℃下冷凝回流提取２次，每次４ ｈ。合并两次提取液，冷冻干燥后得原花青素提取液。 　　１．２．３原花青素萃取分离的方法提取液中的脂类等杂质不利于纯化分析，因此，须对提取液进行萃取分离。①脱脂：向提取液中加入３倍体积的石油醚，混匀，在分液漏斗中静置至分层，放出下层溶液，所放出溶液再重复一遍脱脂操作；②萃取分离：向脱脂后的提取液中加入２倍体积的乙酸乙酯，混匀后在分液漏斗中静置至分层，除去下层溶液保留上层溶液，将上层溶液重复此操作３次，最后蒸馏浓缩除去乙酸乙酯，得到原花青素萃取液。 　　１．２．４NKA树脂吸附的方法 　　１）NKA树脂的预处理。将NKA树脂在无水乙醇中浸泡２４ ｈ，除去树脂中杂质，然后湿法装柱。装好后，用去离子水以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速冲洗树脂柱，直到无乙醇残留；以同样的流速，将０．０５ ｇ／Ｌ的ＨＣｌ通过树脂柱，２ ｈ后再以去离子水洗至中性，接着以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速，将０．０５ ｇ／Ｌ的ＮａＯＨ水溶液通过树脂柱，２ ｈ后再以去离子水洗至其洗出液至中性，备用。 　　２）最佳上样流速的确定。称取３份已处理好的树脂各２ ｇ，分别以流速０．５、１．０、２．０ ｍＬ／ｍｉｎ通入原花青素萃取液，每间隔２ ｍＬ测定流出液吸光值，根据结果确定最佳上样流速。 　　３）最佳上样浓度的确定。将等量原花青素萃取液稀释成不同浓度，然后以最佳上样流速分别通入树脂柱。通过比较吸附前后其吸光值的变化，利用（Ａ０－Ａ１）／Ａ０×１００％计算出吸附率，其中Ａ０为上样液的吸光值，Ａ１为样品全部通过树脂柱后流出液的吸光值。 　　４）最佳洗脱流速的确定。称取２份已处理好的树脂各２ ｇ，分别以最佳上样流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，进样完毕后，依次用体积分数为５０％的乙醇溶液以１.0、２.0 ｍＬ／ｍｉｎ洗脱，每间隔２ ｍＬ测定洗脱液的吸光