猪偶发分枝杆菌核酸修复蛋白基因克隆与序列分析.docVIP

猪偶发分枝杆菌核酸修复蛋白基因克隆与序列分析 　　摘要：以猪源偶发分枝杆菌菌株染色体DNA为模版，以recA基因设计引物进行PCR扩增，获得约1000bp的DNA片段，将扩增产物片段克隆至pGM-T载体中，通过蓝白班筛选、质粒PCR鉴定以及序列分析鉴定，成功构建pGM-T- recA重组质粒，为进一步研究偶发分枝杆菌katGI基因及其在偶发分枝杆菌疾病的检验、免疫和预防治疗提供了一定的基础。 　　关键词：猪源偶发分枝杆菌；katGI基因；克隆；序列分析 　　中图分类号：S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0093-2 　　 　　上个世纪中期以前，非结核分枝杆菌被认为是不致病的，没有引起人们的关注。但随着艾滋病（AIDS）的出现以及临床滥用抗生素和免疫抑制剂等药物，造成患者免疫力下降和强耐药性菌株的不断出现，偶发分枝杆菌（M.fortuitum）等非结核分枝杆菌感染病例的报道日渐增多[1]。研究表明，M.fortuitum与抗生素的滥用有关，且具有极强的适应性，具有变异的可能性，因此，一般检测方法不能检出，普通抗菌药物也不能有效治疗，这给人类的健康造成了严重的困扰。本研究对长春地区正常屠宰的猪体内分离出的M.fortuitum核酸修复蛋白基因（recA）基因进行了克隆并分析其序列，旨在为M.fortuitum的药物开发研究和感染后治疗提供基础分子生物学资料。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　猪偶发分枝杆菌菌种来源于吉林农业大学动物科技学院实验室保存菌种；扩增菌种用培养基为自行配置的改良罗氏培养基；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Buffer为天津天根生化科技（北京）有限公司产品；pGM-T载体、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligation Buffer、2×T4 DNA Ligation Buffer、TOP10感受态细胞、核酸分子量标准D2000及DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒等为天津天根生化科技（北京）有限公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 核酸的提取 将猪源偶发分枝杆菌接种于改良罗氏培养基中培养，一周后刮取适量菌体在TE中混匀后用玻璃棒法提取染色体DNA，测OD值和电泳确定所得核酸质量符合实验要求。 　　1.2.2 引物的设计与合成 由于实验室保存的M. fortuitum菌株没有全基因序列信息，引物设计时考虑使用GeneBank中的标准菌株基因序列??查《伯杰细菌鉴定手册第九版》得M.fortuitum标准菌株为ATCC6841，查GeneBank得ATCC6841的recA基因序列登录号为AY458087.1。据此设计非特异性引物如下：recA-F：CCCGAGTACGCCAAGAAGC；recA-R：CCGTCACGACAGCACCGATA。此引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.2.3 基因的扩增 以猪源M. fortuitum染色体DNA为模版，以recA-F和recA-R为引物进行基因的扩增。PCR反应体系（总体积20μl）包含灭菌双蒸水14.4μl，10×Buffer 2μl，dNTP 1.6μl，模版DNA 1μl，上下游引物（10mmol/μl）各0.5μl, Taq DNA Polymerase（5U/μl）0.2μl。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒，进行30个循环，72℃延伸10分钟。反应结束后，取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。 　　1.2.4 扩增产物的纯化 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳切胶后用天津天根生化科技（北京）有限公司DP209离心柱型普通DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作方法按产品说明书进行。 　　1.2.5 基因的连接与转化 按照pGM-T连接试剂盒说明书要求将纯化的扩增产物与载体在连接酶的作用下16℃连接过夜，再取连接产物与TOP10感受态细胞按1：10转化，并将转化后菌液用无抗LB培养基复苏后涂布到用IPTG(50mg/ml)和X―gal(20mg/ml)处理过的Amp+(0.1mg/ml) LB平板上，干燥后37℃倒置培养过夜。 　　1.2.6 重组质粒的鉴定 挑取白色菌落接种于Amp+ LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，保存菌种后进行PCR菌检、提取质粒PCR检测和双酶切鉴定插入片段是否正确。 　　1.2.7 重组质粒的序列分析 取鉴定为阳性的菌液送北京华大六合基因科技股份有限公司进行测序，并对测序结果用BLAST进行序列分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 基因的扩增 　　以猪源M. fortuitum染色体DNA为模板rec