基因工程物质量控制.ppt

第三节 基因工程药物质量控制 基因工程药物与一般药物比较： ①它是利用活的细胞作为表达系统，所获得蛋白质产品往往相对分子质量较大，并具有复杂的结构； ②许多基因工程药物是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质。 ③宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。 一、基因工程药物质量要求 (1)要求提供关于表达体系的详细资料，以及工程菌(或工程细胞)的特征、纯度(是否污染外来因子)和遗传稳定性等资料。 (2)提供培养方法和产量稳定性、纯化方法以及各步中间产品的收率和纯度、除去微量的外来抗原、核酸、病毒或微生物等方法。 (3)要求进行理化鉴定，包括产品的特征、纯度及与天然产品的一致性。一般纯度应在95%以上。 (4)要求进行外源核酸和抗原检测，规定每剂量DNA含量不超过l00pg，细胞培养产品中小牛血清含量须合格。成品中不应含有纯化过程中使用的试剂，包括层析柱试剂和亲和层析用的鼠IgG。 (5)生物活性或效力试验结果应与天然产品进行比较。 (6)基因工程产品的理化和生物学性质与天然产品完全相同者一般不需重复所有动物毒性试验，与天然产品略有不同者需做较多试验，与天然产品有很大不同者则须做更多试验，包括致癌、致畸和对生育力的影响等。 (7)所有基因工程产品都必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。 二、基因工程药物的质控要点 (一)原材料的控制 (二)生产的控制 (三)最终产品的质量控制※ 1、表达载体和宿主细胞 应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定、表达载体的构建、结构和遗传特性。 2、克隆基因的序列 应提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。 3.表达 应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。 (二)生产的控制 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定， 始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微生物污染。  1、原始细胞库 应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命。应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据。采用新的种子批时，应重新作全面检定。  2、有限代次的生产 提供培养生产浓度与产量恒定性、培养和诱导基因产物的数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数和细胞倍增数。 3、连续培养生产 应提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。 4、纯化 对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。 　 对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。　　 (三)最终产品的质量控制 应建立有关产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法。 (三)最终产品的质量控制 1.产品的鉴定 ①电泳方法 ②免疫学分析方法 ③受体结合试验 ④高效液相色谱法 ⑤肽图分析法 ⑥Edman N末端序列分析法 ⑦圆二色谱法 ⑧核磁共振法 (1) 氨基酸成分分析 　 完整的氨基酸成份分析结果，应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。氨基酸成份分析结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。 部分氨基末端序列分析（N端15个氨基酸）可作为蛋白质和肽的重要鉴别指标。  (2)肽图分析 肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。 肽图分析可作为与天然产品或参考品作精密比较的手段。与氨基酸成分和序列分析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。 (3)重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法等。 蛋白质相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS法。 (4) 蛋白质二硫键分析 测定方法有: 对氯汞苯甲酸法等 5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸法 2、 纯度分析 (1)目的蛋白质含量测定 (2)产物杂质检测